張利平

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州黃巖318026）

幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

張利平

（浙江省柑橘研究所 臺(tái)州黃巖318026）

幾丁質(zhì)酶是一種具有生物催化活性的水解酶，它具有水解幾丁質(zhì)的特異功能，可以將幾丁質(zhì)水解成幾丁糖或者N-乙酰葡萄糖胺。幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上主要是防治害蟲，幾丁質(zhì)酶可以直接作為殺蟲劑或者和其他微生物協(xié)同防治害蟲，幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物中，可以增強(qiáng)植物的抗病性。

1 幾丁質(zhì)

幾丁質(zhì)又稱甲殼素或甲殼質(zhì),學(xué)名為( 1-4)- 2-乙酰胺基- 2-脫氧- β-D葡聚糖,它是由葡萄糖結(jié)構(gòu)單元組成的直鏈多糖,也是唯一含氨基的均態(tài)多糖,結(jié)構(gòu)與纖維素非常相似。幾丁質(zhì)是廣泛分布于自然界的生物多聚物,自然界每年生成的幾丁質(zhì)約有一百億噸,在天然聚合物中幾丁質(zhì)的貯量占第二位,僅次于纖維素。幾丁質(zhì)是構(gòu)成大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分,同時(shí)也大量存在于昆蟲和動(dòng)物的甲殼中[1]。

2 幾丁質(zhì)酶

幾丁質(zhì)酶是一種具有生物催化活性的水解酶，它能特異性地水解幾丁質(zhì)。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶可以從內(nèi)部隨機(jī)打斷幾丁質(zhì)，產(chǎn)生可溶的、小分子量的幾丁四糖、幾丁三糖和幾丁二糖產(chǎn)物。外切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)的非還原末端降解幾丁質(zhì)，產(chǎn)物為N-乙酰葡萄糖胺。根據(jù)其來源不同可以將其分為幾類，即微生物幾丁質(zhì)酶，植物幾丁質(zhì)酶，昆蟲幾丁質(zhì)酶等。

2.1 幾丁質(zhì)酶特性

微生物幾丁質(zhì)酶的分子大小差異很大，一般為10～100 kD，但因其來源不同,差異也很大。目前研究的相對(duì)分子質(zhì)量最大的是Microbulbifer degradans 2～40株的幾丁質(zhì)酶,達(dá)到了140kD。粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)產(chǎn)生五種幾丁質(zhì)酶,其分子量分別為21、36、48、52和57kD,而從擬橄欖綠鏈霉菌(S.olivaceoviridis)的培養(yǎng)液中純化得到的五種幾丁質(zhì)酶其分子量分別為20.5、30、47、70和92kD,皺褶鏈霉菌(S.plicatus)產(chǎn)生的二種幾丁質(zhì)酶分子量分別為49、63kD,紅色鏈霉菌(S.erythraeus)則僅產(chǎn)生一種,分子量為30kD。微生物幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適pH值的變動(dòng)范圍很大，一般認(rèn)為是 3～11，但絕大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶最適pH值為4.0～ 6.0的偏酸性環(huán)境。酶在pH值為3～11時(shí)通常都十分穩(wěn)定，酶的等電點(diǎn)pI為3.6～ 8.6。微生物幾丁質(zhì)酶往往對(duì)熱都比較穩(wěn)定，在 4～60℃時(shí)都具有酶活性，而像激烈熱球菌的幾丁質(zhì)酶在98～100℃時(shí)仍然能正常進(jìn)行水解反應(yīng)，但大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為40～50℃，在-20℃保存 9年仍有酶活性。微生物幾丁質(zhì)酶的這種熱穩(wěn)定性特點(diǎn)，使其在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)方面具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。

植物幾丁質(zhì)酶大部分是小分子蛋白，分子量介于12～55kD之間。在以幾丁質(zhì)為底物時(shí)，最適pH一般低于7，其等電點(diǎn)pI介于3～10之間，對(duì)熱穩(wěn)定（有的酶在60℃仍很穩(wěn)定），抗蛋白酶。植物幾丁質(zhì)酶的等電點(diǎn)有的偏酸,有的偏堿,常稱為酸性或堿性幾丁質(zhì)酶。植物體內(nèi)通常含有一種或幾種幾丁質(zhì)酶,有些植物既含酸性幾丁質(zhì)酶,又含堿性幾丁質(zhì)酶[3]。

昆蟲幾丁質(zhì)酶的分子量在45～85kD之間，酶的活性范圍在pH 4.0～ 8.0之間，等電點(diǎn)在 5.0～ 7.0之間，大多屬于18家族幾丁質(zhì)酶。昆蟲幾丁質(zhì)酶屬于內(nèi)切酶，可將幾丁質(zhì)水解為低分子量的乙酰氨基葡萄糖的寡聚物，如幾丁四糖、幾丁三糖、幾丁二糖[4]。

2.2 結(jié)構(gòu)特征

典型的幾丁質(zhì)酶由N端信號(hào)區(qū)、催化區(qū)和C端延伸區(qū)組成，有的還有幾丁質(zhì)結(jié)合域。各功能域具有各自的功能。

研究表明，多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶的基因以單拷貝形式存在，包括啟動(dòng)子、SD序列、結(jié)構(gòu)基因和終止子，這與原核生物的基因結(jié)構(gòu)相似。在相應(yīng)的酶蛋白結(jié)構(gòu)上有對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，從 N端到 C端依次為信號(hào)肽、幾丁質(zhì)催化區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)以及一個(gè)短的 C端區(qū)。

近些年來，對(duì)多種植物的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆。核苷酸和氨基酸的序列分析表明，植物幾丁質(zhì)酶前體一般都含有一個(gè) N端信號(hào)區(qū)、一個(gè)主結(jié)構(gòu)區(qū)（催化區(qū)）和C端延伸區(qū)，有的在 N端信號(hào)區(qū)之后有富含半胱氨酸的CBD，它與主結(jié)構(gòu)區(qū)之間有一段可變交聯(lián)區(qū)。

無脊椎動(dòng)物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)特征一般包括了催化域、富含Cys的幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)區(qū)、富含Ser/Thr區(qū)(該區(qū)一般糖基化)。昆蟲幾丁質(zhì)酶通常在 N端有一個(gè)催化區(qū)，在 C端有一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)。但也有例外,如Penaeus japonica的 幾丁質(zhì)酶在 N端有一個(gè)CBD,Caenorhaditis elegans幾丁質(zhì)酶在 C端有兩個(gè)CBD等[5]。

3 幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用主要表現(xiàn)在防治害蟲上。幾丁質(zhì)酶可以直接防治害蟲或者與其他微生物協(xié)同防治，幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入到植物中，增加植物對(duì)害蟲的抗病性，達(dá)到防治的作用。

3.1 幾丁質(zhì)酶防治害蟲

幾丁質(zhì)酶可以作為殺蟲劑直接防治害蟲。幾丁質(zhì)是昆蟲外表皮（外骨骼）、呼吸道、腸腔（包括圍食膜）和生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成，并且是外骨骼和圍食膜的主要組成成分，通常占昆蟲體壁干重的25%～40%，而昆蟲變態(tài)發(fā)育的每一次蛻皮都要完成幾丁質(zhì)的更新，也就是消化舊皮層幾丁質(zhì)的同時(shí)合成新皮層的幾丁質(zhì)，這一過程主要依賴于自身分泌的幾丁質(zhì)酶起作用。另外，昆蟲的圍食膜和外骨架是昆蟲抵御病原體重要生理屏障，而昆蟲病原真菌可利用自身的幾丁質(zhì)水解酶和蛋白水解酶突破這種屏障，幾丁質(zhì)是昆蟲殺蟲劑作用的一個(gè)極具吸引力的潛在靶目標(biāo)，通過將幾丁質(zhì)酶導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)來破壞其正常的組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到抑殺害蟲的目的。

3.2 轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)幾丁質(zhì)酶

植物受病原菌侵染后會(huì)產(chǎn)生一系列的主動(dòng)防御反應(yīng),這些反應(yīng)包括:植保素的合成;植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的增強(qiáng);蛋白酶抑制劑及一些水解蛋白的誘導(dǎo)和積累。水解蛋白中研究較多的是幾丁質(zhì)酶。很多植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì),體外抑菌試驗(yàn)表明,幾丁質(zhì)酶能抑制一些病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長。因此,幾丁質(zhì)酶一直被看作是植物抗真菌病害的潛在物質(zhì)?，F(xiàn)在已經(jīng)克隆到了許多幾丁質(zhì)酶基因，這些幾丁質(zhì)酶基因被轉(zhuǎn)到植物中增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害的抵抗力。

20世紀(jì)80年代以來,科學(xué)家已分別將細(xì)菌及植物幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)移到煙草、番茄、大豆、馬鈴薯、葛首、葡萄及甜菜等植物中,獲得了表達(dá)幾丁質(zhì)酶活性的轉(zhuǎn)基因植物。與普通植物相比,轉(zhuǎn)基因植物不僅抗真菌,而且對(duì)線蟲和昆蟲也有一定的抗性。

1996年，Grison等將組成型表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因?qū)敫侍m型油菜中,利用三種病原菌Cylin drosporium concentricum(柱胞霉菌)、Phomalingam（莖點(diǎn)霉菌）、Sclerotinia sclerotiorum（ 菌核菌）做接種實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病害的田間耐性比對(duì)照明顯增強(qiáng)。Lorito等將從Trichoderma harzianum而來的編碼一個(gè)強(qiáng)的抗真菌的幾丁質(zhì)內(nèi)切酶導(dǎo)入煙草和土豆中,獲得了對(duì)Alterbaria alternata、A.solani有很高抵抗力的植株。

通過向植物中導(dǎo)入外源幾丁質(zhì)酶基因,使其在植物體中過量表達(dá),提高植物體對(duì)真菌病害的抗性,幾丁質(zhì)酶基因工程為防治植物真菌病害開辟了一條新途徑,而且在生產(chǎn)試驗(yàn)中顯示出其優(yōu)越性。隨著對(duì)幾丁質(zhì)酶的催化機(jī)制、抗病機(jī)理,以及幾丁質(zhì)酶基因的克隆測序等研究的不斷深入,形成了它的新的應(yīng)用策略。但在實(shí)際應(yīng)用中,還存在一些問題,應(yīng)用于病害防治還需要一些時(shí)間。

3.3 幾丁質(zhì)酶和微生物的協(xié)同作用

幾丁質(zhì)酶與微生物殺蟲劑之間有增效作用。以幾丁質(zhì)酶作為輔劑與Bt劑一起施用可以提高Bt菌的殺蟲效果。Brandt等(1978)發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶可在昆蟲圍食膜上造成穿孔而有利于病原微生物進(jìn)入昆蟲組織。Smirnoff等研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶與蘇云芽孢桿菌一起防治云杉色卷娥能增強(qiáng)Bt的殺蟲效果。Arora等(2003)報(bào)道，幾丁質(zhì)酶Chi36的加入使得Bt對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的半致死濃度降低了30%。劉艷荷(2008)、王芳(2004)等的研究證實(shí)桿狀病毒幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)昆蟲病毒早期侵染和蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)都有明顯的增效作用，Shapiro等人發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶能顯著增強(qiáng)LDNPV對(duì)舞毒娥的致死作用。Dubois等人研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶在體外亦能從3～ 4齡舞毒娥幼蟲中觀察到圍食膜穿孔。用包裹幾丁質(zhì)酶制劑的飼料喂健康的舞毒娥幼蟲，也同樣發(fā)現(xiàn)其圍食膜穿孔[3]。

[ 1]黃崇元.甲殼素資源的綜合利用與發(fā)展[J].濕法冶金,1995,( 9):4～15.

[ 2]王治偉,劉志敏.微生物幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展.生物技術(shù)通訊[J].2006,( 3):439～442

[ 3]歐陽石文,趙開軍,馮蘭香.植物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能、分類及進(jìn)化[J].植物學(xué)通報(bào),2001, 18( 4)：418～426

[ 4]李瑤,范曉軍.昆蟲幾丁質(zhì)酶及其在害蟲防治中的應(yīng)用[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào),2011,48( 5): 1489～1494

[ 5]吳志剛,朱旭芬.幾丁質(zhì)酶的分子生物學(xué)特性及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用[J].生命科學(xué),2002, 14( 2):117～121

2012-12-03