陳琴男 趙翚

●綜 述

殼聚糖及其衍生物在牙周病學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

陳琴男 趙翚

殼聚糖在自然界中來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，且具有較好的生物活性、生物相容性、生物降解性，并易于制成溶液、膜、膠體等各種劑型[1]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。殼聚糖及其衍生物因具有抑菌性、可做緩釋藥物的載體、能促進(jìn)牙周組織的生長(zhǎng)和修復(fù)、骨再生等特性，在牙周病學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越被關(guān)注?，F(xiàn)對(duì)殼聚糖及其衍生物在牙周病學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 殼聚糖及其衍生物的生物基礎(chǔ)研究

1.1 生物相容性和降解性 殼聚糖是從自然界甲殼類動(dòng)物外殼中的甲殼素 [B-（1-4）聚-2-乙酰胺基-D-葡糖]脫乙?；频茫瑲ぞ厶峭ㄟ^(guò)溶菌酶代謝后成為無(wú)毒的D-氨基葡萄糖,作為一種抗菌酶存在于人類唾液中。已有文獻(xiàn)報(bào)道，殼聚糖具有良好的性質(zhì)如生物黏附性、通透性、生物相容性和生物降解性[2-4]。

Peh等[2]使用醋酸和乳酸溶液方法制備醋酸化殼聚糖和乳酸化殼聚糖，并用紋理分析儀檢測(cè)醋酸化殼聚糖、乳酸化殼聚糖的機(jī)械強(qiáng)度和體外黏附強(qiáng)度。乳酸化殼聚糖比醋酸化殼聚糖表現(xiàn)出更低的抗拉強(qiáng)度，但更加柔軟、生物黏附性能更強(qiáng)。乳酸化殼聚糖無(wú)刺激性，不會(huì)導(dǎo)致皮膚過(guò)敏反應(yīng)，進(jìn)行血液注射測(cè)試也無(wú)明顯的不良反應(yīng)。但醋酸化殼聚糖可造成皮膚不良反應(yīng)，如出現(xiàn)紅斑、水腫及系統(tǒng)毒性。因此，Peh等人認(rèn)為乳酸化殼聚糖膜適合在傷口愈合及皮膚燒傷上的臨床應(yīng)用。

Dodane等[3]建立caco-2單細(xì)胞模型，殼聚糖引起可逆的、時(shí)間和劑量依賴性的跨上皮電阻抗的衰減。殼聚糖對(duì)緊密連接的作用通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)甘露醇增加的滲透系數(shù)來(lái)證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞以0.1%～0.5%w/v殼聚糖溶液處理60min后較對(duì)照組細(xì)胞的滲透系數(shù)明顯增加。Vande-Vord等[4]將多孔殼聚糖支架植入小鼠體內(nèi)，然后于1、2、 4、8或12周后處死動(dòng)物，組織學(xué)檢查顯示：經(jīng)標(biāo)記的中性粒細(xì)胞積聚在植入的多孔殼聚糖支架中，隨著植入時(shí)間的推移，殼聚糖支架逐漸降解；革蘭染色和鱟試劑檢測(cè)顯示無(wú)感染或產(chǎn)生內(nèi)毒素的證據(jù)；殼聚糖孔隙內(nèi)可見(jiàn)膠原蛋白，表明結(jié)締組織基質(zhì)沉積在殼聚糖支架內(nèi)；外部植入物多孔殼聚糖支架表面也觀察到相關(guān)的血管生成活性。這一研究表明，殼聚糖在動(dòng)物模型上具有高度的生物相容性和生物降解性。

1.2 抑菌性 有學(xué)者報(bào)道，殼聚糖對(duì)大部分口腔病原體有抗菌性包括牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、放線伴放線桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、綠膿桿菌[5-8]。雖然殼聚糖如何顯示出具體的抗菌作用還不清楚，可能原因在于殼聚糖的質(zhì)子化作用和積極吸引帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁。兩項(xiàng)功能之間的相互作用導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞質(zhì)泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Andres等[9]認(rèn)為，殼聚糖的抗菌機(jī)制是通過(guò)其游離氨基酸群體來(lái)破壞細(xì)胞壁實(shí)現(xiàn)的。Chung等[6]發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)大腸桿菌的滅活通過(guò)兩個(gè)步驟的順序機(jī)制發(fā)生：首先是細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的初步分離，其次是破壞細(xì)胞膜。Ikinci等[3]發(fā)現(xiàn)大分子量的殼聚糖對(duì)牙齦卟啉單胞菌抗菌性更強(qiáng)。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，分子量越大和殼聚糖的脫乙酰程度越高，殼聚糖的抗菌活性越強(qiáng)[5，10]。然而，增加的脫乙酰程度會(huì)引起溶菌酶生物降解的減少。

Chen等[7]對(duì)殼聚糖對(duì)6株包括3種革蘭陰性和3種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的抗菌活性進(jìn)行了研究，并且對(duì)殼聚糖的抗菌活性與殼聚糖的脫乙酰度、濃度和分子量的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估，殼聚糖顯示出對(duì)綠膿桿菌固體的瓊脂抗菌活性最高。當(dāng)細(xì)菌被栽培液體發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)類似的傾向。高脫乙酰度和殼聚糖的濃度高，導(dǎo)致較高的抗菌活性。殼聚糖的分子量的不同對(duì)細(xì)菌的抑制效果的影響是依賴于細(xì)菌的種類。大腸桿菌在其死亡階段和對(duì)數(shù)的階段對(duì)殼聚糖分子量的不同而抗菌效果不同表現(xiàn)明顯。認(rèn)為殼聚糖的抗菌機(jī)制可以通過(guò)細(xì)菌表面的電荷和細(xì)菌和殼聚糖接觸時(shí)間的持續(xù)性來(lái)解釋。No等[10]對(duì)殼聚糖的抑菌活性和6種不同分子量的殼聚糖低聚物（Mws）進(jìn)行測(cè)試，殼聚糖顯示出比殼聚糖低聚物更高的抗菌活性，而且明顯抑制大部分受試細(xì)菌的增殖，雖然不同分子量的殼聚糖與細(xì)菌種類的不同所顯示的抑制效果也不同，0.1%殼聚糖普遍表現(xiàn)出對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌比對(duì)革蘭陰性細(xì)菌更強(qiáng)的抗菌效果。殼聚糖作為溶劑，1%醋酸抑制絕大多數(shù)受試細(xì)菌生長(zhǎng)是有效的，除了乳酸菌，因?yàn)?%乳酸或蟻酸能更有效的抑制乳酸菌。殼聚糖的抑菌活性與pH值（pH測(cè)試范圍值4.5～5.9）呈負(fù)相關(guān)，在較低的pH值下殼聚糖的抑菌活性更高。Bae等[11]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖表現(xiàn)出有效抗變形鏈球菌的作用，并在4d的菌斑再生模式中顯示處重要的抗菌和抗菌斑作用。

1.3 作為緩釋抗菌藥物的載體 Bernardo等[12]和Shen等[13]的體外實(shí)驗(yàn)研究表明，殼聚糖可以作為緩釋抗菌藥物的載體。 Tig li等[14]通過(guò)制備殼聚糖支架，在支架里載入地塞米松或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)。在杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（DPBS）里載入900ng地塞米松的殼聚糖支架以一個(gè)均勻的速度釋放地塞米松，持續(xù)5d全部釋放。bFGF在所有的殼聚糖支架（50ng或100ng）均在10～20h內(nèi)釋放完。

Tada等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖膜含有羥基熒光素和熒光紫杉醇載入的PLGA NPs顯示出雙相釋放特性。在釋放的第一相，78%的CF和34%的NPs在短短數(shù)日內(nèi)釋放。在第二相，釋放變得緩慢，其后3周釋放出額外的22%的CF和18%的NPs。掃描電鏡圖像和動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量表明，NP釋放取決于膜降解率。FPTX-loaded PLGA NPs表明藥物總量的19.8%在2d內(nèi)釋放，接下來(lái)的26d內(nèi)未檢測(cè)到額外的釋放。因此認(rèn)為，殼聚糖膜具有包含PLGA NPs的能力并形成近乎完美的表面覆蓋層，并且能綜合并釋放兩個(gè)有著不同的親水性的藥物，這是一種有前途的局部緩釋藥物釋放平臺(tái)。

1.4 成骨作用 Bhat等[16]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察殼聚糖在骨再生中的作用。其將從黑豚鼠股骨和大鼠的脛骨培養(yǎng)得到的間充質(zhì)干細(xì)胞播種在殼聚糖微粒上，通過(guò)在體外培養(yǎng)干細(xì)胞附著的實(shí)驗(yàn)使細(xì)胞黏附在微粒上5、10、20、30h，間充質(zhì)干細(xì)胞黏附在微粒上的熒光圖像在24h或48h取得，使用活/死細(xì)胞檢測(cè)。間充質(zhì)干細(xì)胞/成骨細(xì)胞播種在微粒上然后使用成骨媒介進(jìn)行體外培養(yǎng)，并且植入到部分骨缺損的大鼠股骨上。在體內(nèi)研究中將大鼠分成實(shí)驗(yàn)和對(duì)照兩組，每組4只。實(shí)驗(yàn)組植入以間充質(zhì)細(xì)胞為種子的微粒，并在4和8周分別觀察；對(duì)照組只植入支持缺陷的不銹鋼板。股骨在植入4和8周后取出，通過(guò)造影、顯微CT、組織學(xué)來(lái)評(píng)估骨缺損位點(diǎn)的骨形成。實(shí)驗(yàn)組在植入8周后觀察到有明顯的骨形成增加。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，殼聚糖微粒被證明是一種很好的骨再生的生物材料。

Yeo等[17]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖膜可以使牙骨質(zhì)和牙槽骨再生。Jung等[18]將酸和聚乙醇酸植入大鼠顱骨缺損上，殼聚糖膜手術(shù)植入在第2、8周局部骨形成得到加強(qiáng)。因此得出殼聚糖膜涂以聚乙醇酸有一個(gè)重要的潛能導(dǎo)致大鼠顱骨缺損模型的骨形成。但聚乙醇酸的劑量范圍和觀察間隔對(duì)骨形成無(wú)明顯差異。Pramanik等[19]將一種新的生物模擬羥基磷灰石/殼聚糖磷酸鹽納米復(fù)合體用一種溶液為基礎(chǔ)的化學(xué)方法合成，其中的羥基磷灰石的含量為10%～60%（w/w），羥基磷灰石和磷酸化殼聚糖的界面粘合，通過(guò)傅里葉變換紅外吸收光譜分析和X射線衍射研究。復(fù)合材料的表面形態(tài)及納米粒子在聚合體基質(zhì)的均勻分散進(jìn)行了研究，分別通過(guò)掃描電子顯微鏡、透射電鏡來(lái)研究。發(fā)現(xiàn)隨著羥基磷灰石在納米粒子中的含量提高，復(fù)合材料的機(jī)械性能有了極大改善。通過(guò)對(duì)小鼠L929成纖維細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，確認(rèn)了納米復(fù)合材料的細(xì)胞相容性。小鼠成骨細(xì)胞初步培養(yǎng)研究證明，納米復(fù)合材料的骨細(xì)胞相容性和很高的體外成骨性。磷酸化殼聚糖的使用促進(jìn)了復(fù)合體基質(zhì)內(nèi)微粒的均勻分布，通過(guò)懸吊的磷酸鹽組團(tuán)與微粒復(fù)合體之間的界面相互作用。這種由單一的微結(jié)構(gòu)組成的生物模擬羥基磷灰石/殼聚糖磷酸鹽納米復(fù)合體可用于骨組織工程。

1.5 屏障膜作用 臨床上采用屏障膜阻止牙齦組織增長(zhǎng)遠(yuǎn)離根面，為有缺陷的組織提供了一個(gè)孤立的空間區(qū)域，使得相對(duì)較慢增長(zhǎng)的牙周韌帶成纖維細(xì)胞重新增殖到牙根面。Kuo等[20]使用3種類型的殼聚糖膜（Chi-NaOH、Chi-Na5P3O10和Na2SO3），在標(biāo)準(zhǔn)化、成骨的和臨界成年大鼠頭骨缺陷區(qū)覆蓋了特別準(zhǔn)備的殼聚糖膜。4周后觀察到骨愈合程度殼聚糖膜組與對(duì)照組有明顯的不同。殼聚糖的覆蓋區(qū)域顯示結(jié)締組織和骨組織邊界間有一個(gè)清晰的空間。顯然，這個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞阻塞和對(duì)骨組織成骨是有益的。對(duì)照組骨缺損區(qū)充滿了結(jié)締組織，觀察到其對(duì)完整的新骨形成破壞。

牙周膜細(xì)胞在牙周組織的再生中起到至關(guān)重要的作用，而且未分化的間充質(zhì)細(xì)胞亞群被認(rèn)為是存在于人群中的。Inanc等[21]進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，將牙周韌帶成纖維細(xì)胞(hPDLFs)封裝在350～450μm范圍的殼聚糖/羥基磷灰石微球內(nèi)，其目的是評(píng)估人hPDLFs封裝在殼聚糖羥基磷灰石微粒（C/HA）中這種三維成骨培養(yǎng)環(huán)境下的成骨分化潛能。結(jié)果證明，hPDLFs在體外誘導(dǎo)，不管是二維還是三維培養(yǎng)條件下，都具有成骨細(xì)胞分化能力。在微重力生物反應(yīng)器里的C/HA微粒可能成為作為一個(gè)合適的三維環(huán)境以支持hPDLFs的體外成骨分化。

2 殼聚糖及其衍生物在牙周病治療中的應(yīng)用

Boynuegri等[22]將20個(gè)慢性牙周炎患者隨機(jī)分為4組：殼聚糖凝膠組（1%w/v）、殼聚糖凝膠（1%w/v）+脫礦的骨基質(zhì)組、殼聚糖凝膠（1%w/v）+膠原膜組、只接受翻瓣術(shù)組（對(duì)照組），通過(guò)術(shù)前及術(shù)后90、180d臨床和影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3組臨床檢測(cè)指標(biāo)無(wú)明顯差異，但影像學(xué)檢測(cè)提示除了對(duì)照組其他組有明顯的差異；與術(shù)前比較，不管是使用殼聚糖、殼聚糖與脫礦的骨基質(zhì)、還是殼聚糖與膠原膜的復(fù)合物都是有前景的牙周再生材料。Aklnclbay等[23]的研究顯示，對(duì)慢性牙周炎患者，在牙周基礎(chǔ)治療后（包括刮治和根面平整），用殼聚糖膠體的濃度（1%w/w）含有或不含有15%的甲硝唑作為牙周局部用藥，殼聚糖本身和殼聚糖與甲硝唑的聯(lián)合制劑是一樣有效的，原因系殼聚糖本身具有抗菌特性。

3 結(jié)語(yǔ)

殼聚糖及其衍生物生物學(xué)特性良好，在牙周病學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂泻芎玫膽?yīng)用前景。由于殼聚糖在牙周疾病的治療中大多處于實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段，相信在不久的將來(lái)，依靠多學(xué)科聯(lián)合應(yīng)用，將能以一種合適的藥物配比和劑型應(yīng)用于臨床，并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；呐R床應(yīng)用。

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2012-06-18）

（本文編輯:歐陽(yáng)卿）

溫州市醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究項(xiàng)目（2011B018）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院溫州市第三臨床學(xué)院（溫州市人民醫(yī)院）

趙翚，E-mail：wzzh009@163.com