陳保紅 耿 亞 馬永明

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河南 漯河 462300）

蜈蚣胃蛋白酶解物體外抗凝活性肽類的分離與分析

陳保紅 耿 亞 馬永明

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河南 漯河 462300）

目的 采用凝膠過濾色譜和C18反相色譜對蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部分進行分離和純化，并檢測其相對分子質(zhì)量分布范圍。方法 光譜法收集各凝膠色譜并分離各流分；用活化部位的凝血活酶時間(APTT)作為指標(biāo)，檢測各流分體外的抗凝活性；用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測其相對分子質(zhì)量的分布范圍。結(jié)果 經(jīng)過濾色譜和C18反相色譜純化后得到了抗凝活性成分，并測得成分中的相對分子質(zhì)量的分布范圍在568～1126之間。結(jié)論 凝膠過濾色譜和C18反相色譜對蜈蚣胃蛋白酶解物的抗凝活性部分進行分離和純化后，抗凝活性組分是小分子肽類。

蜈蚣胃蛋白酶解物；凝膠過濾色譜；C18反相色譜；抗凝活性肽

蜈蚣，民間又被稱為天龍、千年蟲、屬節(jié)肢動物蜈蚣科，關(guān)于它的記載最早的著作是《神農(nóng)本草經(jīng)》，迄今已有2000年的歷史。一般取蜈蚣干燥蟲體入藥，其本身亦有毒性，可以解毒散結(jié)、通經(jīng)絡(luò)止痛等功效。在臨床上多用于治療小兒驚風(fēng)、瘡瘍、腫毒、燙傷、風(fēng)癬等。除此之外，蜈蚣還有治療心血管疾病的功用[1]。蜈蚣的提取物中的有效成分如抗凝活性肽類物質(zhì)在臨床上有著同樣重要的功效。如使血管平滑肌舒張，改善冠脈供血[2]。在動物實驗研究中顯示，蜈蚣提取液對急性心肌缺血的大鼠再灌注損傷的左心功能有明顯的保護作用，而且存在一定的量效關(guān)系[3]。可見，蜈蚣及其提取物對人類健康有著很大的貢獻(xiàn)，在臨床應(yīng)用中有著不可估量的作用，因此，本篇實驗將提取并分離的有效成分做研究，為學(xué)科發(fā)展和臨床應(yīng)用提高科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 儀器準(zhǔn)備

分光光度計、離心機、電子分析天平、恒溫水浴鍋、真空干燥箱、血小板聚集凝血因子分析儀、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜。

1.2 材料準(zhǔn)備

自制蜈蚣胃酶解物、牛血清白蛋白、APTT試劑、乙醇、純凈水、C18反相填料、不同規(guī)格色譜柱、健康的大白兔。

1.3 方法

制備樣品以及空白對照品，對照品即是生理鹽水；在白兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉進行麻醉，后頸動脈取血，離心后取上層清液；取樣品液分別加入APTT試劑，測定APTT值；對蜈蚣胃蛋白酶酶解液進行色譜分離，按色帶標(biāo)記為F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4。將具有抗凝活性的成分繼續(xù)進行色譜分離測定藥效，記錄色帶F3-1，F(xiàn)3-2，F(xiàn)3-3，F(xiàn)3-4；C18反向柱色譜分離藥效成分，標(biāo)記為LF1，LF2(LF2-1，LF2-2)，LF3；HPLC測定抗凝活性成分純度；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜測定成分相對分子量的范圍；APTT抗凝藥效試驗測定藥效成分活性最強物質(zhì)。

2 結(jié) 果

蜈蚣胃蛋白酶酶解液中F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3為蛋白或多肽類成分，APTT藥效顯示F3具有抗凝活性，其中F3-3抗凝藥效最好，經(jīng)體外APTT分析，LF1，LF2均為具有抗凝活性的組分，其中LF2-1，LF2-2活性最強，而LF3無抗凝活性。經(jīng)過分離的成分經(jīng)雙縮脲反應(yīng)均為蛋白或多肽類成分。

3 討 論

本實驗通過多種儀器來分離純化提取蜈蚣胃蛋白酶解物體外抗凝活性肽類，所得的小分子雙縮脲反應(yīng)均為肽類，故稱之為小分子肽類。雖然實驗過程看似復(fù)雜，實則簡單易操作，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，實驗設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，可操作性強。該種方法分離小分子肽類值得推廣。對于動物性藥物成分的提取技術(shù)，該類實驗設(shè)計和方法亦為以后的實驗打下科學(xué)基礎(chǔ)。動物性藥物成分的提取對于學(xué)科發(fā)展、臨床應(yīng)用有著跨時代的意義，大大節(jié)省了材料資源，提高了藥效，減輕了患者藥物在人體內(nèi)代謝的毒副作用。動物藥中主要含有蛋白質(zhì)、肽類以及氨基酸等物質(zhì)，通過科學(xué)的酶解作用，將大分子的蛋白水解為小分子肽類，通過色譜一些列的分離技術(shù)，純化，再提取，再分離，從而最終獲得分子量很小但卻有著完整的抗凝活性的小分子肽類物質(zhì)，在學(xué)科發(fā)展上成為一大突破。這種技術(shù)的應(yīng)用能夠使分子量5000的肽類縮小成為1000以下的小分子肽類。而蜈蚣胃酶解液在葡聚糖凝膠過濾色譜SephadexG-50和G-25柱分離后，通過經(jīng)APTT抗凝血藥效試驗篩選，得到抗凝活性最強的流分F3-3，而后通過經(jīng)C18柱色譜法，依據(jù)洗脫圖譜合并流分，得到了4個組分，這4個組分中，抗凝活性最強的是粉紅色的LF2-1和LF2-1。

[1] 王勇炫,吳偉康,吳以嶺,等.蜈蚣有效部位抗心肌缺血的NO機制研[C].貴陽:全國中藥學(xué)術(shù)研討會論文集,2009:386.

[2] 司秋菊,王鑫國,王亞利,等.蜈蚣對動脈粥樣硬化家兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2010,1(1):5.

[3] 張明泉,王亞利,溫瑞書,等.蜈蚣提取液對大鼠心臟血流動力學(xué)的作用研究[J].河北中醫(yī),2010,26(9):716.

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1671-8194（2013）20-0089-01