謝金文，沈 旭，林初文，沈志強(qiáng)

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的多種禽類易感的一種急性、高度接觸性、毀滅性傳染病，也是目前嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。

1 反向遺傳學(xué)

反向遺傳學(xué)（reverse genetics）是相對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)而言的。經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的表型、性狀到遺傳物質(zhì)來研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律，而反向遺傳學(xué)與經(jīng)典遺傳學(xué)的研究思路正好相反，是直接從生物遺傳物質(zhì)入手，通過對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行加工和修飾來研究基因突變后產(chǎn)生的生物體的特性（表型和性狀等），從而確定生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能以及這些突變可能對(duì)生物體特性的影響。與之相關(guān)的各種研究技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)（reverse genetics manipulation technique）［1－3］，主 要 包 括 RNA 干 擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)、基因沉默技術(shù)、基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)等，是DNA重組技術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)展與延伸。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，RNA病毒研究的快速發(fā)展正得益于此［4－7］。該方法不僅能夠研究病毒基因的功能，而且可以用病毒表達(dá)外源基因。

2 病毒載體

病毒載體（virus vector）是利用重組DNA技術(shù)將外源基因插入經(jīng)過改造的病毒基因組內(nèi)部，而后感染細(xì)胞，使外源基因在細(xì)胞內(nèi)得到有效表達(dá)。病毒載體作為一種常用于分子生物學(xué)的工具，多應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疫苗研究和基因治療等方向。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，催生出了許多RNA病毒載體，如新城疫病毒（NDV）載體等。隨著反向遺傳學(xué)操作技術(shù)的發(fā)展，越來越多的RNA病毒成為病毒載體的研究對(duì)象。

3 重組NDV作為活病毒載體疫苗的優(yōu)點(diǎn)

重組NDV作為活病毒載體疫苗具有極為突出的優(yōu)點(diǎn)：NDV弱毒疫苗長(zhǎng)期以來一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分證明。NDV弱毒苗可同時(shí)誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部黏膜免疫及細(xì)胞免疫的形成，產(chǎn)生更加全面、確實(shí)的保護(hù)。NDV可在體內(nèi)增殖并長(zhǎng)期表達(dá)抗原基因，因此可以誘導(dǎo)持久的保護(hù)作用。NDV疫苗可通過飲水、噴霧、滴鼻、點(diǎn)眼或注射多種方式給苗，使用極為方便。NDV弱毒具有高滴度的雞胚生長(zhǎng)特性，生產(chǎn)成本低廉。NDV遺傳相對(duì)穩(wěn)定，僅有一個(gè)血清型，毒株間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)可能性很小。復(fù)制過程在胞漿內(nèi)完成，從RNA到RNA，不存在DNA階段，故其基因組不會(huì)與宿主細(xì)胞DNA整合，沒有人工轉(zhuǎn)基因的風(fēng)險(xiǎn)。NDV不能在人的正常細(xì)胞中復(fù)制，對(duì)人一般沒有感染性，即使是感染了野生型NDV也只是引起輕微的疾病。一般認(rèn)為，NDV尤其是弱毒株對(duì)人類是安全的。因?yàn)樯鲜鲋T多優(yōu)點(diǎn)，NDV作為病毒載體的應(yīng)用研究也受到了越來越多的關(guān)注［8－9］。本文即對(duì)新城疫病毒反向遺傳載體的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

4 新城疫病毒載體的應(yīng)用

早在2000年，Krishnamurphy等［10］即首次將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）插人到中等毒力毒株Beaudette C株HN基因和L基因之間的間隔區(qū)構(gòu)建重組病毒。與親本株野生病毒相比，該重組病毒在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上的復(fù)制速度和產(chǎn)量均有所下降，但是該重組病毒在CEF上能穩(wěn)定表達(dá)CAT活性8代以上，首次證明NDV可以作為外源基因的表達(dá)載體。

2001年，Nakaya T等［11］把流感病毒（Avian influenza viruses，AIV）A／WSN／33株的 HA 基因插入到NDV弱毒株Hitchner B1基因組的P基因和M基因之間，獲得了含有流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rNDV／B1－HA。rNDV／B1－HA在雞胚連續(xù)傳10代后仍能穩(wěn)定地表達(dá)流感HA蛋白，并且重組病毒已經(jīng)致弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示重組rNDV／B1－HA對(duì)小鼠沒有毒性，小鼠免疫重組病毒后，能夠檢測(cè)到針對(duì)流感病毒HA的高滴度抗體，并且免疫小鼠能夠抵抗致死劑量流感病毒A／WSN／33的攻擊。該年，Huang等［12］將CAT基因插入 NDV La Sota株基因組的3′遠(yuǎn)端緊靠NP基因位置，獲得含有CAT基因的重組新城疫病毒rLa Sota／CAT。連續(xù)傳代12次，該重組病毒仍能高水平的表達(dá)外源基因CAT，表達(dá)的CAT的活性是2000年Krishnamurphy等［10］構(gòu)建的重組病毒rNDV／BC／CAT表達(dá)的CAT活性的11倍。

2002年，Mebatsion等［13］運(yùn)用反向遺傳學(xué)成功獲得了缺乏NP基因優(yōu)勢(shì)免疫抗原表位（IDE）的NDV。鼠肝炎病毒（MHV）S2糖蛋白的一個(gè)B細(xì)胞抗原表位插入到NP蛋白中來替代NP－IDE，表達(dá)MHV的重組病毒被成功的生成，用重組病毒免疫的雛雞能夠產(chǎn)生MHV S2糖蛋白的特異性抗體。因此，在NP基因的可突變區(qū)插入保護(hù)性表位構(gòu)建標(biāo)記疫苗，有助于在臨床上對(duì)NDV進(jìn)行鑒別診斷。

2003年，Engel－Herbert等［14］把綠色熒光蛋白（GFP）基因插入新城疫病毒Clone 30毒株基因組的F基因和HN基因之間，獲得了重組病毒rNDV／GFP1。rNDV／GFP1在雞胚中可穩(wěn)定地表達(dá)GFP，并且其在雞胚中的增殖能力以及對(duì)雞胚的致病性與母本Clone 30毒株沒有明顯的區(qū)別。利用GFP的自發(fā)熒光特性，可以很容易的在器官和組織中發(fā)現(xiàn)感染的細(xì)胞，因此能夠更清楚地了解NDV在體內(nèi)的分布和致病性等情況，顯示了NDV作為疫苗載體的巨大潛力。同年，Zhao等［15］對(duì)NDV作為載體的可行性進(jìn)行了深入研究。他們將人的分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基團(tuán)作為報(bào)告基因，分別插入NDV基因組的 NP－P、M－F、HN－L、基因組5′端，結(jié)果實(shí)驗(yàn)中獲得的重組病毒都能夠不同程度地表達(dá)SEAP基因。

SEAP被插入的前3個(gè)位置，無論是在細(xì)胞上還是在雞胚上都能得到高效表達(dá)，3者之間的表達(dá)水平相當(dāng)，且活性不受影響；而插入基因組5′端這個(gè)位置的重組病毒對(duì)SEAP基因的表達(dá)量則低了不少。從外源基因插入NDV的位置來看，其插入位置越接近NDV基因組的3′末端，其病毒蛋白表達(dá)水平有可能越高。實(shí)驗(yàn)為以NDV為疫苗載體，插入一個(gè)或多個(gè)外源基因，構(gòu)建多價(jià)疫苗提供了更多的插入位點(diǎn)的選擇。

2004年，Huang等［16］又將雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）變異株GLS－5的VP2基因插入到體內(nèi)復(fù)制能力較強(qiáng)、免疫原性良好的NDV La Sota疫苗株基因組的3′端，拯救出能夠表達(dá)VP2蛋白的重組新城疫病毒rLa Sota／VP2。該重組病毒在雞胚上連續(xù)傳12代均可保持遺傳性狀的穩(wěn)定和表達(dá)VP2蛋白，且VP2蛋白不整合到重組病毒粒子中；利用該重組株免疫2日齡SPF雛雞21d后，90%以上可有效抵御IBDV變異株GS－5及新城疫強(qiáng)毒Texas GB的攻擊；加強(qiáng)免疫后則可100%的保護(hù)。Nakaya等［17］利用反向遺傳技術(shù)，將猴免疫缺陷癥病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）病毒的 Gag蛋白在NDV中進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)拯救的重組病毒可誘導(dǎo)針對(duì)Gag蛋白的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用表達(dá)SIV Gag蛋白免疫原部分的重組AIV加強(qiáng)免疫后，則激發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，表明重組的NDV或AIV可作為預(yù)防愛滋病（AIDS）或其他傳染病的候選疫苗。

2005年，Bukreyev A 等［18］將人Ⅲ 型副流感病毒HN基因插入NDV基因組的P基因與M基因之間，獲得重組新城疫病毒。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，免疫該重組病毒的試驗(yàn)動(dòng)物可產(chǎn)生針對(duì)副流感病毒HN蛋白的較高的抗體水平，能夠獲得較好的免疫效果。

2006年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葛金英等［19］把表達(dá)野生型和突變型H5亞型高致病性禽流感HA基因插入到NDV La Sota株基因組的P基因和 M基因之間，獲得了含有禽流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rLa Sota－HAmut。將rLa Sota－HAmut株和NDV La Sota株，感染CEF后收取細(xì)胞液，接種10日齡SPF雞胚，La Sota－HA株接種雞胚內(nèi)達(dá)到與親本La Sota疫苗株相似的生長(zhǎng)滴度，接種9－10日齡SPF雞胚后120h內(nèi)不致死雞胚，并且免疫低日齡SPF雞可誘導(dǎo)高水平的NDV和H5N1亞型AIV特異保護(hù)性抗體反應(yīng)，顯示該疫苗株作為活病毒載體疫苗具有高度安全、雞胚生長(zhǎng)適應(yīng)性及良好的免疫原性。同年，Man等［20］以 NDV B1株為載體，構(gòu)建了能夠表達(dá)H7亞型禽流感病毒的HA蛋白的重組新城疫病毒，用該重組病毒免疫的雞可同時(shí)獲得抵抗NDV強(qiáng)毒和H7AIV的能力：免疫后的雛雞可以完全抵抗NDV強(qiáng)毒的攻擊，對(duì)H7N7高致病性AIV也有90%的保護(hù)率。Veits等［21］構(gòu)建了表達(dá)AIV H5亞型HA的NDV。在Clone 30株NDV F基因和HN基因之間插入高致病性禽流感 A／chicken／Italy／8／98 株 （H5N2 型 ）HA 的ORF，記為NDVH5。然后在 NDVH5的基礎(chǔ)上NDV HA ORF內(nèi)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)通過沉默突變被消除產(chǎn)生重組毒株NDVH5m。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NDVH5進(jìn)行對(duì)照，NDVH5m產(chǎn)生了2．7倍的全長(zhǎng)HA轉(zhuǎn)錄本，表達(dá)了較高水平的HA，同時(shí)也使較多的HA蛋白進(jìn)入病毒外膜。1日齡雛雞腦內(nèi)接種后，2種重組病毒均無毒。用NDVH5m免疫雛雞后，再分別用致死劑量的velogenic型NDV或高致病性AIV進(jìn)行攻毒，發(fā)現(xiàn)用NDVH5m誘導(dǎo)的NDV抗體和AIV抗體對(duì)雛雞有很好的保護(hù)率，異常的是流感病毒的脫落沒有被觀測(cè)到。此外，用NDVH5m免疫接種，在血清學(xué)上可將禽流感疫苗接種產(chǎn)生的抗體與野毒感染產(chǎn)生的NP蛋白抗體相區(qū)別。因此，重組體NDVH5m可作為一個(gè)非常合適的二價(jià)疫苗候選毒株。

2007 年，Dinapoli等［22］將 高 致 病 性 禽 流 感（HPAIV）H5N1HA基因插入新城疫病毒基因組中，研制出一種可表達(dá)HPAIV H5N1HA蛋白的試驗(yàn)型弱毒疫苗，并將其直接接種呼吸道。研究表明：該疫苗可預(yù)防H5N1所帶來的死亡和降低發(fā)病率，此外還可誘導(dǎo)大量的黏膜免疫球蛋白A的反應(yīng)。在呼吸道誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)的最大特點(diǎn)是很可能在爆發(fā)或流行中減少或防止病毒傳染。該重組新城疫病毒是一個(gè)疫苗候選株，可用于臨床評(píng)價(jià)人類HPAIV疫苗。同年，Dinapoli等［23］還將與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征相關(guān)的冠狀病毒SARS－CoV的S蛋白插入NDV弱毒株的P－M位點(diǎn)，構(gòu)建了重組新城疫病毒表達(dá)載體。通過呼吸道用2個(gè)劑量的疫苗免疫非洲綠猴，其產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)相當(dāng)于非洲綠猴免疫其他試驗(yàn)制備的SARSV疫苗并再用SARSV攻毒產(chǎn)生二次反應(yīng)時(shí)的抗體效價(jià)。當(dāng)動(dòng)物免疫重組病毒并用高劑量的SARSV攻毒時(shí)，在病毒復(fù)制的高峰期直接檢測(cè)肺組織病毒量，結(jié)果與對(duì)照組動(dòng)物相比，免疫組動(dòng)物肺部SARSV效價(jià)降低。證實(shí)其在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中具有較好的免疫原性和保護(hù)性，是一種非常有潛力的疫苗載體。

2008年，葛金英等［24］又以La Sota株為載體，構(gòu)建了表達(dá)超強(qiáng)毒vvIBDV GX分離株VP2基因的重組 La Sota疫苗株rLa Sota－VP2。重組疫苗株rLa Sota－VP2以106．0EID50一次免疫7 日齡 SPF雛雞，免疫后3周對(duì)新城疫強(qiáng)毒致死攻擊100%保護(hù)，對(duì)vvIBDV攻擊免疫保護(hù)率達(dá)90%以上。重組病毒rLa Sota－VP2保持了La Sota親本疫苗株高滴度的雞胚生長(zhǎng)特性、高度生物安全性及遺傳穩(wěn)定性。為研制傳染性法氏囊?。鲁且咧亟M二聯(lián)活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

2009年，胡順林等［25］利用反向遺傳技術(shù)將NDV強(qiáng)毒株ZJ1的F裂解位點(diǎn)序列進(jìn)行改造，成功拯救 出 重組 毒 株 NDV／ZJ1HN。利 用 NDV／ZJ1HN免疫2周齡雞，免疫后4周用基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒可獲得比傳統(tǒng)疫苗La Sota株更好的免疫保護(hù)，提示NDV／ZJ1HN有可能作為一個(gè)理想候選疫苗株用于生產(chǎn)中對(duì)基因Ⅶ型NDV流行株的防控。同年，Nayak B等［26］將 H5N1亞型高致病 性禽 流感病 毒 A／Vietnam／1203／2004 的HA基因插入到NDV La Sota株中，獲得了含有禽流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rNDV－HA，用其免疫14日齡SPF雞，免疫3周后對(duì)H5N1亞型禽流感病毒及新城疫強(qiáng)毒均具有較好的保護(hù)。陳化蘭等［27］應(yīng)用新城疫病毒為骨架的反向遺傳學(xué)平臺(tái)，得到表達(dá)H5N1亞型禽流感HA蛋白的重組病毒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，免疫雞產(chǎn)生很強(qiáng)的抗體水平，能夠?qū)ν蛣e和不同型別的H5N1病毒攻擊產(chǎn)生保護(hù)力。

5 小 結(jié)

當(dāng)前，利用反向遺傳操作技術(shù)，以NDV作為疫苗載體的研究已經(jīng)得到快速的發(fā)展。相信隨著分子生物學(xué)各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，NDV作為一種有效的病毒載體定會(huì)受到越來越多的關(guān)注、具有越來越廣闊的應(yīng)用前景。

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