吳 青 王樂(lè)樂(lè)

（1.河南省洛陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，洛陽(yáng) 471003；

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

飼料中營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)方法研究進(jìn)展

吳 青1王樂(lè)樂(lè)2

（1.河南省洛陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，洛陽(yáng) 471003；

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

隨著飼料加工工業(yè)的快速發(fā)展，飼料中營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)作用越來(lái)越重要。飼料中蛋白質(zhì)、鈣、磷和鹽在動(dòng)物生命活動(dòng)和生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。因此，快速準(zhǔn)確的測(cè)定飼料中這些營(yíng)養(yǎng)素的含量具有重要意義。本文主要對(duì)飼料中蛋白質(zhì)、鈣、磷和鹽的檢測(cè)方法的原理和技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行了綜述，簡(jiǎn)單介紹了一些方法改良后的效果，并對(duì)不同的方法進(jìn)行了簡(jiǎn)單的比較，以期能有效的指導(dǎo)實(shí)際檢測(cè)過(guò)程。

1 蛋白質(zhì)檢測(cè)

飼料蛋白包括真蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)2種含氮物質(zhì)。前者對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)發(fā)育具有不可替代的作用，后者主要是一些游離氨基酸、硝酸鹽和氨等，不能反映蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但飼料產(chǎn)品中規(guī)定的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)都是以“粗蛋白”表示的，目前國(guó)內(nèi)外采用的檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法有自動(dòng)定氮儀法、凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲分光光度法、Lowry 法、馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）、二辛可酸比色法（BCA法）、熒光光度法和羅丹明生物探針?lè)ǖ取?/p>

1.1 凱氏定氮法

國(guó)標(biāo)GB／T6432～1994規(guī)定用凱氏定氮法測(cè)定飼料中的含氮量，當(dāng)飼料中含有非蛋白氮時(shí)，該方法會(huì)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果。其測(cè)定的原理是在硫酸和催化劑的作用下將蛋白質(zhì)中的氮轉(zhuǎn)化成硫酸氨，加入強(qiáng)堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再用酸溶液滴定。測(cè)出的氮含量，乘以6.25計(jì)算出粗蛋白的含量[1]。該法耗時(shí)長(zhǎng)，而且消化是否完全、催化劑量是否合理，滴定時(shí)的操作都影響結(jié)果[2]。

目前，在食品蛋白檢測(cè)領(lǐng)域，已對(duì)該法進(jìn)行了一些改良[3～4]，但該法過(guò)程繁瑣，不適用于大量樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，一般只被飼料行業(yè)作為驗(yàn)證蛋白質(zhì)含量的方法。

1.2 紫外吸收法

蛋白質(zhì)分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收峰在280 nm處，而且在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光度與其濃度成正比，但如果蛋白質(zhì)中含有核酸雜質(zhì)，而核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，就要采用校正之后的值，即使用280 nm和260 nm的吸收差。蛋白質(zhì)溶液在238 nm的光吸收值與肽鍵的含量成正比，可以利用這一特性，進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定，這種方法不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定，因此，在酶和蛋白質(zhì)的生化制備中很常見(jiàn)。如果樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)有很大干擾[5]。含核酸雜質(zhì)時(shí)盡管結(jié)果經(jīng)過(guò)校正，但由于不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，所以，還是存在誤差的。

1.3 雙縮脲法（Biuret）

蛋白質(zhì)分子含有2個(gè)以上肽鍵，肽鍵與雙縮脲（NH2CONHCONH2）結(jié)構(gòu)相似，在強(qiáng)堿性溶液中能與Cu2+產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，且紫紅色絡(luò)合物的深淺與蛋白質(zhì)濃度，在一定范圍內(nèi)符合朗伯-比爾定律，蛋白質(zhì)濃度越高，體系的顏色越深。該絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)為560 nm，在合適的堿性強(qiáng)度下，將一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液與雙縮脲試劑反應(yīng)，并于560 nm比色，做出標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到未知飼料樣品蛋白質(zhì)的濃度。有該反應(yīng)的不一定都是蛋白質(zhì)和多肽，NH3也可以干擾該反應(yīng)，另外，脂濁也是很大一個(gè)干擾因素，常用的雙縮脲試劑由兩種溶液組成，質(zhì)量濃度為0.1g/ml的NaOH溶液和質(zhì)量濃度為0.01 g/ml的CuSO4溶液，楊愛(ài)華[6]將雙縮脲試劑由單試劑改為雙試劑方法，認(rèn)為能排除脂濁的干擾，具有很好的準(zhǔn)確度。

另外，還有Lowry法、自動(dòng)定氮儀法、考馬斯亮藍(lán)G250（Bradford）法、二辛可酸比色法（BCA法）、熒光光度法等都常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，自動(dòng)定氮儀法測(cè)定成本高，Bradford是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定的方法，BCA反應(yīng)簡(jiǎn)單，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，但反應(yīng)試劑昂貴，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。

2 鹽分測(cè)定

飼料中鹽分的測(cè)定一般有2種途徑：（1）測(cè)定Cl，求出含鹽量；（2）測(cè)定Na，求含鹽量。后者通過(guò)火焰光度簡(jiǎn)單易行，但對(duì)工廠設(shè)備要求較高而沒(méi)有普及，一般都是采用滴定法測(cè)量Cl。目前，一般都采用國(guó)標(biāo)GB／T6439-92進(jìn)行鹽分的測(cè)定，這個(gè)方法盡管可以連續(xù)進(jìn)行測(cè)定總鈣磷，但由于操作繁雜，時(shí)間很長(zhǎng)，不能快速有效的測(cè)出結(jié)果，李愛(ài)軍[7]等人采用直接和快速2種方法并進(jìn)行了改良，并且分析了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可代替性，認(rèn)為在一定的條件下可以相互代替，對(duì)于檢測(cè)大量樣品時(shí)可以采用直接法和快速法。但是我們知道，飼料中的鹽分一般都是指氯化鈉，但是測(cè)定的時(shí)候還包括氯化膽堿中的水溶性氯離子，使測(cè)得結(jié)果偏高。另外，現(xiàn)在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不僅對(duì)氯要求，對(duì)鈉要求更加敏感。因此，在實(shí)際中亟待需要找到一個(gè)可以準(zhǔn)確測(cè)定NaCl的方法為實(shí)際工作服務(wù)。

3 鈣磷含量測(cè)定

3.1 鈣

飼料中鈣的測(cè)定方法已有許多研究，常用的有高錳酸鉀法、EDTA法、雙氧水法、分光光度法。高錳酸鉀法是國(guó)標(biāo)法測(cè)定飼料中鈣含量的方法[8]，首先將試樣中的有機(jī)物破壞，將鈣沉淀，再用高錳酸鉀定量測(cè)定鈣的含量，該法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且高錳酸鉀溶液不穩(wěn)定需要長(zhǎng)時(shí)間滴定。EDTA法是根據(jù)鈣離子在堿性溶液中與EDTA二鈉絡(luò)合，置換出鈣紅指示劑，而使溶液變成純藍(lán)色[9]。該法比高錳酸鉀法簡(jiǎn)單、快速。有研究報(bào)導(dǎo)指出，鈣含量不同，EDTA法和國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果精確度是不一樣的，可以根據(jù)不同的鈣含量選擇不同的方法[10～11]。這樣既可以保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，又可以選擇簡(jiǎn)便、快速的方法。雙氧水法避免了灰化法不完全的弊端，并且可以連續(xù)測(cè)定磷和蛋白，節(jié)省了很多人力、物力、財(cái)力。另外還有均項(xiàng)沉淀法，分光光度法等。

3.2 磷

磷的測(cè)定方法有很多，如氣相色譜法、導(dǎo)數(shù)極譜法、X-熒光光譜法和原子吸收法等。這些方法多數(shù)對(duì)儀器要求高，測(cè)定過(guò)程較繁瑣，并沒(méi)有廣泛的推廣應(yīng)用，而國(guó)標(biāo)采用的磷鉬釩分光光度法共存離子干擾少，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高，是測(cè)飼料中磷含量最廣泛的分析方法之一。除此法外，還有鉬藍(lán)法，由于其測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，而在國(guó)標(biāo)測(cè)定飼料中的鈣和總磷時(shí)，干法分解樣品，除了鹽酸的濃度不同外，其余試劑操作過(guò)程均相同。在測(cè)鈣要求采用1：3鹽酸溶液，而在測(cè)總磷要求采用1：1鹽酸溶液，有學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可以用GB／T6436-2002方法測(cè)鈣后的試樣分解液測(cè)定飼料中的總磷，也可以用GB／T6437-2002方法測(cè)磷后的試樣分解液測(cè)定飼料中的鈣。這樣既可以快速獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果又可以提高工作效率，在飼料生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行大批量測(cè)定飼料中鈣和總磷時(shí)，效果十分明顯[12]。

飼料中蛋白質(zhì)、鹽分、鈣和磷是畜禽必須的營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)動(dòng)物的健康生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能的提高有著不可或缺的作用。

[1] 劉箭.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[2] 李雷，顧麗群，何 虎，等.凱氏定氮法測(cè)定飼料中粗蛋白質(zhì)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題[J].貴州畜牧獸醫(yī).2010，34（5）：43.

[3] 楊翠英，王小杰，楊增，等.奶粉中蛋白質(zhì)樣品消化方法的改進(jìn)[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，22（3）：378-380.

[4] 夏道宗，陳明之，于新芬.采用過(guò)氧化凱氏定氮法在食品蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用[J].食品與藥品，2005，7（4）：54-56.

[5] 李存富.關(guān)于蛋白質(zhì)測(cè)定中幾個(gè)問(wèn)題的理論分析與討論[J].中國(guó)釀造，2004，（9）：29-30.

[6] 楊愛(ài)華.單試劑與雙試劑雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的比較[J].淮海醫(yī)學(xué)，2006，24（4）：35.

[7] 李愛(ài)軍，齊靜，劉建英.飼料中鹽分測(cè)定方法比較研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005，32（10）：10-11.

[8] 楊勝.飼料分析與飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999.

[9] 秦山，鄭金玉，齊德生.兩種方法測(cè)定飼料中鈣含量的比較[J].飼料工業(yè)，2003，24（12）：44-45.

[10] 張玲，汪瀾.兩種測(cè)定飼料中鈣含量的方法比較[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004，（1）：53.

[11] 查林.兩種鈣測(cè)定法（EDTA法、KMnO4法）的精密度的比較[J].黔西南民族師專學(xué)報(bào)，2001，（3）：63-65.

[12] 楊紹君.國(guó)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定飼料中鈣和總磷的探討[J].江西飼料，2010，（4）：24-25.