國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局杭州醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州 310009）

一次性使用真空采血管又叫一次性使用人體靜脈血樣采集容器，簡(jiǎn)稱(chēng)采血管，是用于體外診斷檢查，制造商預(yù)期一次使用，含有一定真空度的商品。由蓋帽、塞子、試管、添加劑或附加物等組成。根據(jù)臨床需求不同，產(chǎn)品添加劑可以有很多種不同類(lèi)型，比如添加劑EDTA 類(lèi)，為血常規(guī)管，用于血液學(xué)血常規(guī)、全血檢測(cè)；添加劑為肝素類(lèi)，用于快速血漿生化、血流變檢測(cè)；添加劑為檸檬酸鈉類(lèi)，有血凝管用于凝血機(jī)制（PT、APTT、凝血因子）檢測(cè)，有血沉管用于血細(xì)胞沉降率檢測(cè)；有促凝管用于生化、免疫、血清等檢驗(yàn)血液樣本的采集和貯存等等。這些產(chǎn)品具有一定的促凝或者抗凝作用，但是產(chǎn)品的性能怎樣完全取決于產(chǎn)品的預(yù)置真空度和添加劑的多少。當(dāng)產(chǎn)品的真空度確定時(shí)，完全取決于產(chǎn)品中添加劑的多少。本文以添加劑為檸檬酸鈉溶液的血凝管和血沉管為例，介紹檸檬酸鈉溶液濃度的檢測(cè)方法。

檸檬酸鈉溶液作為采血管的抗凝劑之一，對(duì)產(chǎn)品性能起著至關(guān)重要的作用，因而有必要控制真空采血管中檸檬酸鈉溶液的濃度。在YY0314-2007《一次性使用人體靜脈血樣采集容器》附錄NC 中，檸檬酸鈉用于凝血化驗(yàn)的抗凝劑濃度應(yīng)為（105～109）mmol/l（即3.13%～3.2%，通常被稱(chēng)為3.2%）的二水合物形式的檸檬酸鈉[1]，用于血細(xì)胞沉降率檢測(cè)的抗凝劑濃度應(yīng)為（123～135）mmol/l（3.61%～3.96%,通常被稱(chēng)為3.8%）的二水合物形式的檸檬酸鈉。本文分別通過(guò)滲透壓法、高效液相色譜法、非水滴定法、原子分光光度法對(duì)檸檬酸鈉溶液濃度進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)比較，確定了簡(jiǎn)單可行的檢測(cè)方法。

1.儀器與材料

1.1 儀器

滲透壓摩爾濃度測(cè)試儀（天津天河醫(yī)療儀器有限公司SMC-30C），高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司），原子分光光度計(jì)（美國(guó)PE 公司AA800），超純水機(jī)（默克密理博Milli-Q）。

1.2 材料

選用實(shí)驗(yàn)室檢品為本次試驗(yàn)樣品，檸檬酸鈉二水合物（分析純），乙二酸（分析純），磷酸（色譜純），甲醇（分析純），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），高氯酸（0.1mol/l 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液），冰乙酸（分析純），乙酸酐（分析純），結(jié)晶紫（分析純），鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（500mg/l,國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GSB07-1262-2000，鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液證書(shū)101405）。

2.方法

2.1 滲透壓法

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密稱(chēng)取檸檬酸鈉10g，置100ml 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度約為100mg/ml 的溶液，再精密量取上述溶液適量，制成含檸檬酸鈉為10-100mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版附錄ⅨG 滲透壓摩爾濃度測(cè)定法，分別測(cè)定每點(diǎn)的滲透壓。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并求出回歸方程。

2.1.2 樣品溶液的制備

取采血管樣品，分別測(cè)定每管的滲透壓，將樣品測(cè)定值代入回歸方程并計(jì)算樣品中檸檬酸鈉溶液的濃度。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 測(cè)試條件

色譜柱：KC-811；流動(dòng)相：0.5%磷酸溶液；流量：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測(cè)器：UV；進(jìn)樣量：10μl。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備

將檸檬酸鈉在105℃條件下干燥3h 后，精確稱(chēng)取2.5g 于50ml 容量瓶中，溶解，稀釋?zhuān)瑩u勻，定容，即得到標(biāo)準(zhǔn)貯備液50mg/ml。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)原液制備

精確移取2.2.2.1 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)貯備液5ml、12.5ml 分別置于25ml 的容量瓶中，用水稀釋?zhuān)瑩u勻，定容，即得到標(biāo)準(zhǔn)原液10mg/ml、25mg/ml。

2.2.2.3 內(nèi)標(biāo)液制備

精確稱(chēng)取0.5g 乙二酸到500ml 的容量瓶中，用水稀釋?zhuān)芙?、搖勻，定容即得。

2.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)液制備

分別精確移取10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml標(biāo)準(zhǔn)原液2ml 到100ml 容量瓶中，再加入3ml 的乙二酸內(nèi)標(biāo)液，用水稀釋?zhuān)瑩u勻，定容，得到0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

用高效液相色譜儀對(duì)2.2.2.4 項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)試，以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程。

2.2.3 供試液的配制與測(cè)試

取采血管，第一次稱(chēng)重得W1（g），用約20ml 的水充分轉(zhuǎn)移采血管內(nèi)檸檬酸鈉溶液至50ml 的容量瓶中，再加入3ml 乙二酸內(nèi)標(biāo)液后，用水稀釋?zhuān)瑩u勻，定容得供試液。用高效液相色譜儀測(cè)定供試液，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到供試液濃度C（mg/ml）,吹干采血管內(nèi)壁第二次稱(chēng)重得W2（g），樣品中檸檬酸鈉溶液的密度以1.0g/ml計(jì)算。

2.2.4 計(jì)算公式

CX=50×1.0×C/294.1×(W1-W2)

CX—樣品中檸檬酸鈉溶液的濃度，mol/l；

C—表示檸檬酸鈉溶液的測(cè)試濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出，mg/ml；

（W1-W2）—表示采血管內(nèi)檸檬酸鈉溶液的重量，g

2.3 非水滴定法

2.3.1 樣品前處理

取20 支采血管，分別用實(shí)驗(yàn)用水將樣品內(nèi)的檸檬酸鈉溶液充分轉(zhuǎn)移至100ml 的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干。

2.3.2 測(cè)定方法

取上述蒸干后的檸檬酸鈉固體粉末,用適量約10ml 冰乙酸加熱充分溶解并轉(zhuǎn)移到碘量瓶中,放冷，加乙酸酐10ml,再加 0.5%結(jié)晶紫溶液2 滴,用0.1N 的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液顯藍(lán)綠色,同時(shí)做空白滴定試驗(yàn) 進(jìn)行校正。

2.3.3 計(jì)算公式

C X=N(V-V 0)×0.0 9 8 0 3×1 0 0 0/294.1×20×V1

CX—檸檬酸鈉溶液濃度，mol/l；

N—高氯酸標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量濃度；

V—試樣滴定消耗用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,ml；

V0—空白滴定消耗用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,ml；

V1—采血管中檸檬酸鈉溶液的體積，ml；

0.09803 —1 毫克當(dāng)量檸檬酸鈉的質(zhì)量，g。

2.4 原子分光光度法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

依據(jù)樣品中鈉的濃度以及鈉元素的檢測(cè)范圍，選擇以下濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)?0μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml。

2.4.2 樣品溶液的制備

取2 只采血管樣品，分別用超純水轉(zhuǎn)移至50ml 容量瓶中，反復(fù)清洗，合并所有清洗液，加水稀釋至刻度，搖勻，分別用0.45μm 的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，即得二份供試品溶液。按照同樣方法制備空白對(duì)照液。

2.4.3 試驗(yàn)方法

分別將鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同濃度進(jìn)樣，得到不同的吸收率，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸收率為縱坐標(biāo)，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，同樣的方法將樣品溶液分別進(jìn)樣，從曲線(xiàn)上可以讀取樣品的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出檸檬酸鈉溶液的濃度。

2.4.4 計(jì)算公式

X=C×50×0.001/23×V×3

X—樣品中檸檬酸溶液的濃度,mol/l；

C—曲線(xiàn)上鈉元素的濃度，μg/ml；

V—樣品中檸檬酸鈉溶液的體積，ml。

3.結(jié)果

3.1 滲透壓法（表1）

表1.滲透壓法

3.2 高效液相色譜法（表2）

表2.高效液相色譜法

3.3 非水滴定法（表3）

表3.非水滴定法

3.4 原子分光光度法（表4）

表4.原子分光光度法

4.試驗(yàn)討論

從以上試驗(yàn)可以看出，每種方法都可以作為檢測(cè)一次性使用真空采血管中檸檬酸鈉溶液濃度的方法，但是每種方法又有著不同的優(yōu)缺點(diǎn)。滲透壓法檢測(cè)檸檬酸鈉溶液濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9998，過(guò)程簡(jiǎn)單，使用的儀器為滲透壓儀，價(jià)格便宜，可操作性強(qiáng)，為方便接受的一種方法；高效液相色譜法檢測(cè)檸檬酸鈉溶液濃度，雖然相關(guān)系數(shù)為0.9999，但是試驗(yàn)過(guò)程較復(fù)雜，使用的儀器為高效液相色譜儀，價(jià)格昂貴，試驗(yàn)的可接受程度不強(qiáng)，只能是有條件的單位方可采用的方法；非水滴法測(cè)定檸檬酸鈉溶液的濃度，試驗(yàn)結(jié)果平行樣結(jié)果良好，重現(xiàn)性也好，但是由于該過(guò)程試劑的配制比較繁瑣，同時(shí)用到試劑乙酸酐，為有毒試劑，在市場(chǎng)上不容易買(mǎi)到，需要專(zhuān)一的領(lǐng)導(dǎo)和技術(shù)人員通過(guò)專(zhuān)一的培訓(xùn)后，取得資質(zhì)后方可獲得，給試驗(yàn)的進(jìn)行帶來(lái)了一定的難度，故該方法也受到一定的限制；原子分光光度法測(cè)定檸檬酸鈉溶液的濃度，相關(guān)系數(shù)為0.9997，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度較強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，但是同樣用到的儀器為原子分光光度計(jì)，價(jià)格也是比較昂貴，該方法操作起來(lái)受到資金的限制，并不是每一個(gè)生產(chǎn)企業(yè)都可以達(dá)到的，所以也不是最為理想的方法。綜上，滲透壓法檢測(cè)檸檬酸鈉溶液濃度為一理想的、可操作性強(qiáng)的、可普及的可靠方法。