陳 楠,戴傳云*
(重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,重慶 401331)
中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)歷史悠久,風(fēng)味獨特,深受人們喜愛。傳統(tǒng)發(fā)酵食品包括白酒、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵調(diào)味制品、發(fā)酵蔬菜制品及發(fā)酵肉制品等,這些都是我國食品工業(yè)的重要組成部分。傳統(tǒng)發(fā)酵食品獨特的風(fēng)味及品質(zhì)與其復(fù)雜的微生物群落關(guān)系密切,如:白酒繁雜的風(fēng)味與酒曲、酒醅、窖泥中的微生物菌群密不可分;腌漬蔬菜在乳酸菌作用下產(chǎn)生酸爽口感;腌制肉制品色澤和質(zhì)構(gòu)的穩(wěn)定離不開乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌等微生物。近年來研究發(fā)現(xiàn),除原料本身的生物活性物質(zhì)外,傳統(tǒng)發(fā)酵食品還能在微生物和酶的作用下產(chǎn)生多糖、生物活性肽、維生素等功能因子[1],具有較高的營養(yǎng)保健價值,開發(fā)潛力巨大。但傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中普遍存在工業(yè)化程度低、產(chǎn)品品質(zhì)不均一及不良微生物污染等問題,制約了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)展。利用多菌種在生產(chǎn)過程中形成優(yōu)勢菌群,調(diào)控代謝,能提高產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)效率,是實現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)的有力手段。本文將綜述多菌種生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的現(xiàn)狀及存在的問題,并提出解決措施。
在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中的組合使用,多菌種發(fā)酵在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[2]。國內(nèi)外研究者在多菌種發(fā)酵食品的工藝、微生物作用機理、風(fēng)味形成及發(fā)酵劑制備等方面進行了多項研究,如日本繼承和發(fā)揚了多菌種醬油釀造技術(shù),已成為醬油生產(chǎn)強國;韓國利用乳酸菌發(fā)酵蔬菜已實現(xiàn)了工業(yè)化[3];歐洲和北美洲是商業(yè)化發(fā)酵劑的主要生產(chǎn)地(表1)。我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品主要利用多菌種或多菌種與酶的混合制劑生產(chǎn),菌種從產(chǎn)品及生產(chǎn)環(huán)境中分離純化,主要為乳酸菌等細菌及酵母、霉菌等真菌(表2)。
表1 商品化食品發(fā)酵劑供應(yīng)商及產(chǎn)品Table 1 Commercial suppliers of food fermentation starters
從我國古老的大曲釀酒到目前各種冷凍干燥發(fā)酵劑
表2 我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品主要接種微生物及其發(fā)酵方式Table 2 Main starter strains and fermentation styles of traditionally fermented foods in China
多菌種發(fā)酵可提高原料利用率、縮短加工周期,提高生產(chǎn)效率。沈國華[13]利用多種乳酸菌發(fā)酵蔬菜并對溫度進行控制,發(fā)現(xiàn)接種后發(fā)酵速度比自然發(fā)酵提高3倍。李正國[14]研發(fā)的榨菜人工發(fā)酵劑可將榨菜生產(chǎn)周期由90d縮短至45d。趙麗華等[15]利用復(fù)合發(fā)酵劑及戊糖片球菌生產(chǎn)羊肉香腸,結(jié)果表明多菌種發(fā)酵羊肉香腸的咀嚼性、膠黏性高于對照組,復(fù)合發(fā)酵劑接種后先于對照組形成優(yōu)勢菌群,其次生代謝物與原料中蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)作用加速風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)形成。翟瑋瑋[16]利用根酶、米曲霉、黑曲霉分別制曲混合發(fā)酵生產(chǎn)醬油,提高了蛋白酶活力和原料利用率,產(chǎn)品中總氮、氨基酸態(tài)氮含量增加,在后熟期添加乳酸菌和酵母菌,能改善醬油風(fēng)味。
利用多菌種發(fā)酵可改善產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)。發(fā)酵乳制品采用不同乳酸菌進行組合發(fā)酵,可減少生產(chǎn)中噬菌體污染,生產(chǎn)出不同益生特性、酸度、黏性的產(chǎn)品,如雙聯(lián)或三聯(lián)益生菌組合發(fā)酵的乳制品能改善人體腸道菌群,增強免疫能力[17]。Minervini等[18]篩選出Streptococcusthermophilus、Lactobacilluscasei兩種乳酸菌發(fā)酵羊乳,產(chǎn)品中益生菌的數(shù)量大于107CFU/g,并產(chǎn)生了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE-I)抑制肽、γ-氨基丁酸(GABA)兩種生物活性物質(zhì),為開發(fā)功能性發(fā)酵羊乳提供了新思路。Mollet[19]利用敲出ldhD基因的乳酸菌LactobacillusjohnsoniiLa1發(fā)酵牛乳,該乳酸菌僅代謝產(chǎn)生可消化的L-乳糖,不產(chǎn)生D-乳糖,使得發(fā)酵牛乳制品的消化利用率得到了提高。Plaude等[20]用Streptococcus thermophilus、Lactobacillushelveticu和Bifidobacterium longum三種益生菌純種接種、混合接種生產(chǎn)醬油,醬油中大豆異黃酮及B族維生素含量較對照組均有提高。
多菌種發(fā)酵食品的品質(zhì)與菌種的組合方式、接種量、發(fā)酵時間、溫度等因素關(guān)系密切。Kourkoutas等[21]采用冷凍干燥方法制備了克菲爾發(fā)酵劑,并用于生產(chǎn)弗塔型干酪。實驗考察了發(fā)酵劑添加量、不同生產(chǎn)工藝條件等因素對弗塔型干酪感官品質(zhì)的影響,并利用固相微萃取-氣相-質(zhì)譜法(SPME-GC-MS)方法對發(fā)酵劑生產(chǎn)的干酪香味成分進行了系統(tǒng)分析,結(jié)果表明,發(fā)酵劑接種量對產(chǎn)品品質(zhì)影響顯著,克菲爾發(fā)酵劑接種量為1g/L、氯化鈉含量為7%時生產(chǎn)的干酪具有更好的風(fēng)味及更長的貨架期。
發(fā)酵食品中生物胺、亞硝酸鹽的含量等被認為是影響其安全性的因素之一。接種合適的菌種可對產(chǎn)品中生物胺、亞硝酸鹽含量進行控制。Mohamed等[22]接種Lactobacillusplantarum2142、Lactobacillus caseisubsp.casei2763 和Lactobacillus curvatus2771控制德國泡菜中生物胺含量,結(jié)果證實接種上述乳酸菌能明顯抑制游離氨基酸生成從而降低組胺、腐胺等生物胺含量。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在多菌種生產(chǎn)的發(fā)酵肉類制品中,如Muhammad等[23]接種Staphylococcus carnosusFS19 和Bacillus amyloliquefaciensFS05發(fā)酵魚肉香腸,120d后實驗組中生物胺總量比對照組分別降低15.9% 和12.5%。Yan Pingmei等[24]篩選出Lb.pentosus和Leu.Mesenteroides作為泡菜發(fā)酵菌種,進行發(fā)酵實驗,結(jié)果顯示發(fā)酵劑能抑制硝酸鹽還原細菌Enterobacteria的增殖,這解釋了乳酸菌發(fā)酵劑能降低腌漬蔬菜亞硝酸鹽含量的原因。乳酸菌在發(fā)酵過程中還能產(chǎn)生乳酸細菌素,抑制腐敗菌的生長,被認為是天然安全的防腐劑[25]。Tolonena等[26]利用多種乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)泡菜,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中均含有不同量的乳鏈菌肽(Nisin),能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄糖球菌、沙門氏桿菌等增殖,具有廣譜抗菌性,可提高發(fā)酵食品安全性。
利用多菌種生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品,須首先掌握其微生物群落組成及動力學(xué)特征。傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜,而對此開展的生態(tài)學(xué)研究尚處于起步階段,對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落組成、微生物群落與環(huán)境的相互作用、微生物群落功能的研究尚不深入,特別是少數(shù)民族傳統(tǒng)發(fā)酵食品,因地域性強,對其微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究則更少。這些方面,基礎(chǔ)研究的薄弱限制了多菌種聯(lián)合發(fā)酵在生產(chǎn)中的應(yīng)用。
多菌種發(fā)酵應(yīng)用的難點在于缺乏高性能菌種,因此篩選和改良菌種的功能也是需要解決的問題之一。我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中部分微生物生境特殊(高鹽、酸性、乙醇、煙熏等),導(dǎo)致其代謝途徑特異,能產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的次生代謝物,優(yōu)良微生物資源十分豐富,而目前對這種資源的發(fā)掘不足。一方面,當(dāng)前所用菌種主要通過自然篩選方法從產(chǎn)品或生產(chǎn)環(huán)境中獲得,這種篩選途徑效率低,篩選到適合于生產(chǎn)的優(yōu)良發(fā)酵菌種難度大;另一方面,篩選菌種的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、遺傳特性及食品加工性能等基礎(chǔ)研究薄弱,缺乏對野生型菌種功能和性狀的定向改良,在生產(chǎn)中易發(fā)生性能衰退及自然變異,不利于發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化和均一化。
利用多菌種生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品能提高生產(chǎn)效率、確保產(chǎn)品品質(zhì)均一,但也可能影響產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)。接種多菌種可能改變傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu);多菌種的接種方式、發(fā)酵時間、接種量、菌種配比等不當(dāng)也會對產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響,如果多菌種發(fā)酵降低甚至喪失了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的原有風(fēng)味特色,那么這種工藝革新便失去了意義。目前傳統(tǒng)發(fā)酵食品中各風(fēng)味物質(zhì)的平衡、功能物質(zhì)的形成與微生物群落的關(guān)系尚未全部闡明,接種多菌種對發(fā)酵食品優(yōu)勢菌群的影響、發(fā)酵代謝的調(diào)控等問題也需要深入研究。如何在利用多菌種提高生產(chǎn)效率與保持傳統(tǒng)發(fā)酵食品優(yōu)良特性間找到平衡,也是多菌種生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品面臨的挑戰(zhàn)。
發(fā)酵菌種的安全隱患主要來自四個方面:菌種的致病性;菌種產(chǎn)生的次生代謝物、抗生素、激素等物質(zhì)對人的潛在危害;基因工程技術(shù)改良菌種的生物安全問題及生產(chǎn)過程中不良微生物的二次污染。這些問題與傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝及微生物的特性相關(guān),為多菌種發(fā)酵在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應(yīng)用帶來一定的安全隱患。另外,隨著益生菌資源的開發(fā),越來越多的國外益生菌申請進入國內(nèi)市場,這些益生菌能否分享傳統(tǒng)發(fā)酵菌種的安全性,益生菌在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中應(yīng)用的安全風(fēng)險如何進行評估等也是需要解決的問題之一。
優(yōu)良的商業(yè)化發(fā)酵劑是實現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化的必要條件。目前我國缺乏能滿足不同特征產(chǎn)品生產(chǎn)所需的商業(yè)化發(fā)酵劑。就乳酸菌發(fā)酵劑而言,我國多數(shù)發(fā)酵乳制品企業(yè)靠進口國外冷凍干燥乳酸菌發(fā)酵劑[25]。國內(nèi)還沒有供發(fā)酵蔬菜制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵豆類制品等食品生產(chǎn)的專門商業(yè)化發(fā)酵劑。除菌種因素外,發(fā)酵劑制備中的關(guān)鍵技術(shù)問題(如菌種的擴大培養(yǎng)、高效菌體保護劑的篩選、菌粉的冷凍干燥及保藏、凍干菌粉復(fù)水性等)尚未解決,阻礙了發(fā)酵劑的開發(fā)和生產(chǎn),造成商業(yè)化發(fā)酵劑缺乏。
針對多菌種發(fā)酵在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題,提出以下解決措施:
利用宏基因組學(xué)(metagenomic)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)(metaproteomic)技術(shù)開展傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物生態(tài)學(xué)研究。近年來興起的宏基因組學(xué),可通過提取環(huán)境中所有微生物的DNA,對其進行序列和功能分析,從而反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性[27],該技術(shù)包括DNA提取純化、宏基因組文庫構(gòu)建及目標(biāo)克隆子篩選等步驟,用于研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物能更準(zhǔn)確地掌握其菌群多樣性及結(jié)構(gòu)組成,避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法所得微生物群落信息不全面的缺點,同時也可對發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌、功能菌和功能性酶類進行篩選,目前已有研究者開始對中國大曲酒微生物宏基因組進行研究[28]。在發(fā)酵食品微生物宏基因組數(shù)據(jù)不斷積累的基礎(chǔ)上,可進一步利用宏蛋白質(zhì)組學(xué)把微生物群落組成與其功能聯(lián)系起來,研究不同時間、不同空間中基因的表達,掌握菌群落動態(tài)變化過程,分析發(fā)酵食品中微生物群落的功能及微生物群落與環(huán)境間的相互作用。利用這些研究結(jié)果建立相應(yīng)信息數(shù)據(jù)庫,為多菌種聯(lián)合發(fā)酵在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論依據(jù)。
對我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中優(yōu)良菌種進行收集和開發(fā),逐步建立傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫,為篩選和改良發(fā)酵菌種提供資源。同時對生產(chǎn)中使用菌種的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等生物學(xué)信息進行研究,為菌種的定向改良奠定基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,發(fā)酵菌種選育也由自然篩選發(fā)展到對菌種的設(shè)計和改良,如利用重組工程技術(shù)改良乳酸菌,使其表達重要蛋白(如風(fēng)味酶、轉(zhuǎn)運蛋白、防腐劑、調(diào)節(jié)蛋白等)以及通過調(diào)控細胞內(nèi)關(guān)鍵酶活性,促進目標(biāo)代謝物表達,使其更適應(yīng)于工業(yè)生產(chǎn)[29-31]。應(yīng)利用原生質(zhì)融合、基因工程、空間誘變育種等新技術(shù)定向選育出更多的適合我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn),具有自主知識產(chǎn)權(quán)的發(fā)酵菌種。
傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味形成與原料、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)工藝、微生物的活動密不可分。微生物代謝的酶類將原料中的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等分解成氨基酸、寡糖為其生長提供營養(yǎng),同時也形成風(fēng)味物質(zhì)的前體,而代謝生成的乙醇、乙醛、乳酸、丁酸乙酯等則直接形成產(chǎn)品的風(fēng)味。多菌種生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品,應(yīng)明確各產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的主體成分及形成機理。利用食品風(fēng)味化學(xué)分析新技術(shù)如氣相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-吸聞技術(shù)、電子鼻技術(shù)[32]等加強對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的特征風(fēng)味的分析研究,構(gòu)建傳統(tǒng)發(fā)酵食品的特征風(fēng)味指紋圖譜,與感官評價相結(jié)合,指導(dǎo)菌種選擇和組合配比;功能性物質(zhì)的積累應(yīng)利用基因組學(xué)研究方法從基因水平闡述微生物代謝與傳統(tǒng)發(fā)酵食品功能物質(zhì)積累的關(guān)系,指導(dǎo)多菌種發(fā)酵對功能物質(zhì)積累的調(diào)控,使其達到傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味和品質(zhì)的要求。
最大程度降低食品工業(yè)用菌種的安全風(fēng)險,需要加強對菌種的食用歷史、菌種與寄主的相互作用,菌種在胃腸道的定殖性、轉(zhuǎn)移性、繁殖性等進行研究。對于基因工程改造菌種應(yīng)進行嚴格的安全評價。在生產(chǎn)過程中,傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按危害分析和關(guān)鍵控制點(HACCP)實施指南進行管理,提高發(fā)酵食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn),防止生產(chǎn)中有害菌二次污染污染。
直投式發(fā)酵劑無需進行活化、擴培等預(yù)處理,可省去菌種車間,簡化生產(chǎn)工藝,使生產(chǎn)規(guī)范化[33],在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。對直投式發(fā)酵劑制備中的科學(xué)問題進行研究,利用透析培養(yǎng)、耦合發(fā)酵、代謝調(diào)控等技術(shù)手段改進菌種高密度培養(yǎng)技術(shù);在細胞和分子水平上研究冷凍干燥過程中保護劑對微生物細胞的保護機制,設(shè)計高效保護劑,提高直投式發(fā)酵劑菌種存活率,保護其發(fā)酵性能;利用冷凍干燥、真空噴霧干燥等技術(shù)開發(fā)單一或復(fù)合菌種,便于組合出適合不同產(chǎn)品生產(chǎn)需要的多菌種發(fā)酵配方,滿足各生產(chǎn)需要。
我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品是勞動人民生產(chǎn)生活中的智慧結(jié)晶[34],是我國寶貴的文化遺產(chǎn),也是重要的食品資源,應(yīng)著力推進傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化進程,使其更具有市場競爭力。傳統(tǒng)發(fā)酵食品市場廣闊,發(fā)展?jié)摿薮?,利用多菌種組合發(fā)酵的優(yōu)勢,對傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)工藝進行革新并解決多菌種發(fā)酵生產(chǎn)傳統(tǒng)食品過程中的問題,對繼承和發(fā)展傳統(tǒng)發(fā)酵食品,促進行業(yè)健康發(fā)展有重要意義。
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