，,2，,2，,2，,2，

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600;2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司， 山東 濱州 256600)

示差折光檢測(cè)器(Refractive Index Detector，RID)是一種高度穩(wěn)定和靈敏的液相色譜和凝膠滲透色譜用檢測(cè)器。其原理是通過(guò)比較折光率的變化來(lái)檢測(cè)流動(dòng)相中的樣品峰。對(duì)于只有紫外末端吸收的物質(zhì)，用紫外檢測(cè)時(shí)靈敏度相對(duì)較低，同時(shí)易發(fā)生基線漂移，而用示差折光檢測(cè)器時(shí)可取得較為理想的結(jié)果，如聚合物、糖、有機(jī)酸等。目前HPLC-RID檢測(cè)物質(zhì)含量多應(yīng)用于醫(yī)藥及食品行業(yè)，本文就示差折光檢測(cè)器在藥物含量檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以利于示差折光檢測(cè)技術(shù)的更廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 皂苷元含量測(cè)定

傳統(tǒng)的皂苷元含量測(cè)定多采用薄板層析配合薄板掃描方法或比色法。前者無(wú)法分離某些結(jié)構(gòu)相似的皂苷元成分，難以做到對(duì)單一組分的定性、定量測(cè)定，后者也只能對(duì)總皂苷元的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用中受到較大限制。高效液相色譜配示差折光檢測(cè)器作為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的研究方法，具有高效率、高精密度、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在各領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

采用反相高效液相色譜配示差折光檢測(cè)器(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC-RID)法對(duì)知母不同炮制品中薩爾薩皂苷元進(jìn)行分離分析,樣品用乙醇提取后采用氯仿進(jìn)行萃取，發(fā)現(xiàn)生品、清炒、鹽炙、酒炙及麩炒品中薩爾薩皂苷元含量分別為1.219%、1.344%、1.772%、1.275%和1.519%。采用RP-HPLC-RID法建立了復(fù)方知母膠囊中菝葜皂苷元的含量測(cè)定方法。當(dāng)以純甲醇為流動(dòng)相，被測(cè)定峰與雜質(zhì)峰分離度良好，線性范圍為1.0～7.0 μg，平均回收率98.66%。采用RP-HPLC，利用C18柱和RID比較了蒺藜全草和果實(shí)中主要甾體皂苷元的含量差異,證實(shí)全草與果實(shí)中的?？稍碥赵肯嘟?，而替告皂苷元含量有極顯著差異(P<0.01)，從而確定替告皂苷是蒺藜全草的主要指標(biāo)成分。

2 內(nèi)酯含量測(cè)定

銀杏中含有豐富的黃酮類成分，另有萜類、酚類以及多種微量元素、維生素和氨基酸等，在防治心血管病、抗老防衰、保護(hù)肌膚、抗癌、抗菌、抗過(guò)敏有很好的療效。其中含有的黃酮類和內(nèi)酯類成分均有較強(qiáng)的紫外吸收，且黃酮類紫外吸收大于內(nèi)酯類，因此，測(cè)定其中的內(nèi)酯類成分時(shí)，多運(yùn)用RID方法，其原理系利用樣品與流動(dòng)相折光率不用而檢測(cè)樣品，具有通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便及對(duì)黃酮類響應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)。王淑君等[1]測(cè)定了銀杏葉緩釋膠囊中銀杏內(nèi)酯的含量，白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯A、B、C在10～80 mg/L濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，獲得了較高的靈敏度。采用HPLC-RID測(cè)定銀杏總內(nèi)酯注射液中銀杏總內(nèi)酯的含量，以Dikama Diamosil C18為色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(35:6),表明白果內(nèi)酯在0.206～2.060 mg/mL、銀杏內(nèi)酯A在0.150～1.500 mg/mL、銀杏內(nèi)酯B在0.102～1.020 mg/mL、銀杏內(nèi)酯C在0.056～0.560 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。同時(shí)該方法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。商軍等[2]采用HPLC-RID法對(duì)天然甜菜堿(三甲胺乙內(nèi)酯)的含量進(jìn)行測(cè)定，在2.005～10.026 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率達(dá)98.8%，與GB/T 2515-2008《飼料添加劑天然甜菜堿》中的離子色譜和高氯酸滴定方法相比，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于飼料添加劑中天然甜菜堿的含量測(cè)定。

3 糖類成分含量測(cè)定

3.1 單糖含量測(cè)定

柯云翠等[3]以鈣型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂為固定相，采用HPLC-RID對(duì)復(fù)方甘露醇注射液中甘露醇和葡萄糖的含量進(jìn)行檢測(cè)，甘露醇在0.15～15 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.1%；葡萄糖在0.05～5 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率100.1%。周禮玲等[4]建立了HPLC-RID法同時(shí)測(cè)定替硝唑與葡萄糖含量的方法。該方法采用氨基鍵合硅膠色譜柱，替硝唑和葡萄糖分別在0.10～0.50 g/L和1.25～6.25 g/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.3%和99.8%，測(cè)定結(jié)果與藥典方法一致，但可省去藥典中兩種物質(zhì)分別測(cè)定的繁瑣，可以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定樣品的含量，有利于藥品的快速檢測(cè)。

3.2 寡糖含量測(cè)定

邱建國(guó)等[5]建立了地黃寡糖簡(jiǎn)便有效穩(wěn)定的測(cè)定方法。采用NH2-C18色譜柱分離，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)測(cè)定地黃中寡糖。結(jié)果表明，水蘇糖在0.0978～0.3260 mg時(shí)呈良好的線性關(guān)系，回收率達(dá)99.43%。采用RP-HPLC-RID建立了保健品中蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量測(cè)定方法，以Zorbax NH2為色譜柱，蔗糖、棉子糖和水蘇糖的線性范圍分別為2.38～23.8、2.04～20.4、2.24～22.4 μg/mL，加樣回收率分別為96.4%、97.5%和97.4%。邱建國(guó)等[6]考察河南新鄉(xiāng)、西峽、三門峽、溫縣、淮陽(yáng)以及甘肅慶陽(yáng)、清水、金崖、大康營(yíng)等地的生地黃中所含地黃寡糖和梓醇的含量。采用水為溶媒，超聲提取糖類成分，NH2色譜柱分離，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)測(cè)定；采用甲醇為溶媒，超聲提取梓醇，C18色譜柱分離，210 nm處測(cè)定紫外吸收值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地生地黃中梓醇成分的含量差異則不是很大，其中甘肅產(chǎn)地的相對(duì)較高。水蘇糖量最高，產(chǎn)地不同，有所差異，所有產(chǎn)地均含有棉子糖，量相對(duì)較高，水蘇糖與棉子糖含量呈正比關(guān)系，各地甘露三糖含量較低，部分地區(qū)生地中甚至無(wú)甘露三糖。該結(jié)論進(jìn)行的HPLC法測(cè)定地黃及含地黃成藥中寡糖所得結(jié)論一致。邱建國(guó)等[7]采用NH2-硅膠色譜柱分離考察了河南新鄉(xiāng)、西峽、三門峽、溫縣、淮陽(yáng)以及甘肅慶陽(yáng)、清水、金崖、大康營(yíng)等地的生地及炮制所得熟地中含地黃寡糖的量，以棉子糖、甘露三糖和水蘇糖為考核指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生地黃中水蘇糖量最高，產(chǎn)地不同，有所差異，所有產(chǎn)地均含有棉子糖，量相對(duì)較高，水蘇糖與棉子糖含量呈正比關(guān)系，而各地甘露三糖含量較低，部分地區(qū)生地中甚至無(wú)甘露三糖。

3.3 多糖成分及含量測(cè)定

田艷玲等[8]采用示差折光分析法測(cè)定飲料中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。色譜柱為AgilentCar-bohydrate，流動(dòng)相為乙腈-水(75:25)。該方法的檢出率0.5%，加標(biāo)回收率92.0%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.13%。歐陽(yáng)華學(xué)等[9]采用示差折光法建立了同時(shí)測(cè)定枸杞中單糖和低聚糖的方法。鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖在10.0～400.0 mg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9976～0.9998。精密度RSD分別為2.15%、1.49%、1.09%、3.82%、4.65%，加標(biāo)回收率為92.27%～101.93%，該方法的檢出限分別達(dá)到4 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg。梁蔚陽(yáng)等[10]建立同時(shí)測(cè)定注射用轉(zhuǎn)化糖中果糖與葡萄糖含量的高效液相色譜示差折光檢測(cè)法。采用氨基鍵合硅膠柱(250 mm,4.6 mm,5 m)，流動(dòng)相為乙腈-水(85:15)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果糖和葡萄糖分別在0.1266～0.8861 mg和0.1263～0.8842 mg濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率分別為99.8%和99.7%。顏軍等[11]建立了用示差折光高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方胃蛋白酶顆粒中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的方法。選用色譜柱為Sugar-D，流動(dòng)相為乙腈-水(78:22，V/V)。結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖能較好分離，在0.50～10.00 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；葡萄糖回收率為94.3%～103.7%，蔗糖回收率為101.4%～105.1%；經(jīng)不確定度評(píng)價(jià)合成不確定度為1.92%，擴(kuò)展不確定度為4.1%。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可用于復(fù)方胃蛋白酶顆粒中葡萄糖、蔗糖的含量測(cè)定。張進(jìn)杰等[12]以市售淡水魚為試材，建立水產(chǎn)品中還原糖(葡萄糖、核糖)、磷酸化糖(磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖)和蔗糖的定性、定量檢測(cè)方法。用乙醇/水提取魚肉中各糖物質(zhì)，經(jīng)樹脂吸附處理后，對(duì)魚肉中各糖物質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，各糖物質(zhì)分離效果較好，各物質(zhì)線性關(guān)系良好，回收率在70.2%～98.5%之間，重復(fù)性RSD均小于5%。劉瀟瀟等[13]采用HPLC-RID法建立了同時(shí)測(cè)定參芪扶正注射液中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。果糖、葡萄糖和蔗糖進(jìn)樣量分別在19.1～127.3(r=0.9998)、15.9～106.5(r=0.9996)和6.5～43.5 μg(r=0.9996)范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為97.3%、99.2%和95.6%，RSD分別為4.2%、4.4%、5.2%，操作簡(jiǎn)便，可用于參芪扶正注射液的質(zhì)量控制。劉泰然等[14]將保健食品經(jīng)水提取，在沸水浴中用硫酸水解，用氫氧化鈉調(diào)成中性后以乙腈+水(70:30)為流動(dòng)相，通過(guò)氨基柱分離后用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，同一樣品在水解前后木糖含量的差值即為樣品中低聚木糖的含量。木糖濃度在0.30～4.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.86%～3.80%。

銀杏外種皮多糖(Ginkgobilobaexocarppolysac-charides, GBEP)是從銀杏種實(shí)的外種皮中提取制得的，具有抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生物學(xué)活性。其中含有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分，還含有少量單糖，而單糖在紫外檢測(cè)器中幾乎無(wú)吸收峰，多糖的吸收峰也很小，而在示差折光檢測(cè)器中能有效地將各種組分分離。魯萍等[15]采用示差折光檢測(cè)器測(cè)定銀杏外種皮多糖的分子質(zhì)量及含量，以葡聚糖為標(biāo)樣，PLaquagel-OHMIXED(7.5 mm×300 mm,8 μm)為色譜柱，發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮多糖的分子質(zhì)量為11062.5，RSD為0.78%(n=6)；含量為68.7%，RSD為3.4%(n=6)，葡聚糖(分子質(zhì)量為12000)在1～20 μg呈良好線性關(guān)系(r=0.9999)，平均加樣回收率為97.9%，RSD為2.5%。郭守軍等[16]利用配示差折光檢測(cè)器的高效液相色譜外標(biāo)法直接分離分析半乳甘露聚糖膠中單糖的組成，木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖的分離可在20 min內(nèi)完成，檢測(cè)限分別為2.0 μg、20 μg、1.0 μg和20 μg，線性范圍為2～10 mg/mL。

4 其他藥物成分測(cè)定

張佩軍等[17]用高效液相色譜法測(cè)定了霍膽丸的含量，豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸在20～99.96 μg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系，甲氧回收率分別為99.58%和99.39%。池玉梅等[18]采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)黃芪及黃芪精口服液中黃芪甲苷的含量，在1～5 μg范圍內(nèi)，結(jié)果均呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為98.3%和98.1%。與紫外檢測(cè)法相比較，該方法靈敏度更高，同時(shí)消除了紫外檢測(cè)法由于黃芪甲苷的檢測(cè)波長(zhǎng)在末端吸收而存在的干擾大的問(wèn)題。顧振宇等[19]用甲醇超聲提取蟲草素、水超聲提取蟲草酸，再用高效液相色譜、示差折光檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器串聯(lián)的方法測(cè)定蟲草素和蟲草酸含量。二者檢出限分別為50 ng/mL和1.5 μg/mL，回收率在90%～101%之間。

5 展 望

隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的日益重視，中藥在獸醫(yī)臨床獲得了廣泛應(yīng)用，但目前大部分成分尚無(wú)含量測(cè)定方法。作為一種高度穩(wěn)定、靈敏的通用型檢測(cè)器，示差折光檢測(cè)器具有廣泛的使用范圍，可彌補(bǔ)紫外檢測(cè)器的不足，在聚合物、糖類、有機(jī)酸、甘油三酸酯、高分子化合物、脂肪烷烴等物質(zhì)測(cè)定方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已成為一種重要的分離分析技術(shù)，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

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