楊 柳，鄭 華，張邑帆，付利芝，黃金秀，周曉蓉，楊飛云*

(1．重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌，402460；2．農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 榮昌，402460；3．養(yǎng)豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 榮昌，402460)

近些年來，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，許多活菌被選作益生菌用以調(diào)整動物腸道內(nèi)正常的微生態(tài)平衡，其中的芽孢形成菌廣泛地用作微生態(tài)飼料添加劑[1]。由于孢子具有對不良環(huán)境的抗性，長時間保存的特點，孢子就成為益生素菌種最優(yōu)先選擇的生物質(zhì)形式[2]。凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)是一株目前公認為安全的芽胞形成菌[3]，廣泛地用作飼料添加劑的益生菌種(http://www.aafco.org/)。它能較好的防控腹瀉、促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、提高豬平均日增重和降低飼料成本[4]。作為一株益生菌種，凝結(jié)芽孢桿菌的液體發(fā)酵研究比較深入，但由于該方法需要精密的儀器、專業(yè)的技術(shù)人員和大量的能源，以及產(chǎn)生大量的廢棄物等的不足[5]，推廣很受限制。然而，由于固體發(fā)酵具有操作簡單、可利用農(nóng)副產(chǎn)物和幾乎不產(chǎn)生廢物的特征[6]，近些年來固體發(fā)酵法在一些國家，特別是在發(fā)展中國家再次受到了高度的關(guān)注。

本研究凝結(jié)芽胞桿菌固體發(fā)酵中的底物、濕度、初始pH和添加營養(yǎng)物質(zhì)等各項因素對芽胞形成的影響，確定了固體發(fā)酵的最佳條件，為提高菌種芽孢的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本、促進工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子菌液的制備

將種子菌(即凝結(jié)芽孢桿菌重慶分離株1，B.coagulansCQ1)接種于LB平板培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)24 h，活化菌種。之后挑取單菌落，接入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，37 ℃，150 r/min振搖過夜培養(yǎng)，測定OD450值。

1.2 發(fā)酵條件的篩選

1.2.1 固體發(fā)酵與芽孢計數(shù) 稱量底物20 g，裝到250 mL三角瓶中，加入適當量的溶液，混合均勻后115 ℃滅菌30 min，冷卻到室溫。取2 mL種子菌液加到滅菌生理鹽水中，混勻，添加到滅菌冷卻底物之中，攪拌均勻，使固體發(fā)酵培養(yǎng)基的最終濕度達到約65%。37 ℃培養(yǎng)48 h。之后將發(fā)酵物低于50 ℃烤干，芽孢計數(shù)按照Prakasham的方法執(zhí)行[7]。

1.2.2 底物的篩選 取不同底物(主要麥麩、玉米粉、谷草粉和糠粉)進行固體發(fā)酵和芽孢計數(shù)，根據(jù)芽孢形成的量，篩選出最佳底物。

1.2.3 添加物的篩選 按照文獻8的方法，在篩選的底物中添加1.0 %的碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖和甘油)和氮源(硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉和豆粉餅)，以及鹽類物質(zhì)(KH2PO41.00%, NaH2PO41.00%, K2HPO41.50%, Na2HPO41.50%；MnSO40.10%，MCl20.10%)，對照組中只加水，進行單因素固體發(fā)酵和芽孢計數(shù)。根據(jù)芽孢形成的量，篩選出最佳添加物。

1.2.4 濕度的篩選 在篩選的底物中添加適宜的水分，使?jié)穸确謩e達到50%、55%、60%、65%、70%，進行固體發(fā)酵和芽孢計數(shù)。根據(jù)芽孢形成的量，篩選出最佳濕度。

1.2.5 pH的篩選 在篩選的底物中添加一定的水分，將初始pH調(diào)整到pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH9.5和pH10.0，分別進行固體發(fā)酵和芽孢計數(shù)。根據(jù)芽孢形成的量，篩選出最佳pH。

1.2.6 培養(yǎng)基的優(yōu)化配比 根據(jù)確定的最適碳源和氮源以及磷酸鹽和金屬錳離子，設(shè)計了L9(34)的正交試驗表(見表1)，優(yōu)化B. coagulations CQ1菌株產(chǎn)生芽孢的固體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組分配比試驗。發(fā)酵條件為：37 ℃，pH 7.5，濕度為60%，進行固體發(fā)酵與芽孢計數(shù)。采用正交設(shè)計軟件“正交設(shè)計助手II”的直觀分析法進行統(tǒng)計分析。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test g/kg

1.2.7 優(yōu)化發(fā)酵條件的驗證 將優(yōu)化的固體培養(yǎng)基與空白對照同時接種等量的種子菌，進行固體發(fā)酵及芽孢計數(shù)，分析優(yōu)化固體培養(yǎng)基促進芽胞形成的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同底物對B. coagulans固體發(fā)酵的影響

由于農(nóng)(副)產(chǎn)物的資源存量、價格和保存時間等是影響其選擇為固體發(fā)酵底物的關(guān)鍵因素，試驗結(jié)合實際選擇以麥麩、糠粉、玉米粉和谷草粉等農(nóng)副產(chǎn)物為發(fā)酵底物，它們對B. coagulans固體發(fā)酵形成芽孢的影響結(jié)果見圖1。由圖可知隨著農(nóng)副產(chǎn)物的不同，種子菌固體發(fā)酵形成芽孢的效果不一樣，其中的麥麩是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的最佳底物物質(zhì)，能提供較好的介面。由于固體發(fā)酵過程中，固體底物具有雙重功能，一方面是底物為微生物生長繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面是提供微生物的粘附的功能。同時也暗示該菌能夠較容易地破碎麥麩皮，并利用麥麩中的營養(yǎng)物質(zhì)進行繁殖，這為深入開展麥麩作為底物的固體發(fā)酵生產(chǎn)芽孢奠定基礎(chǔ)。

2.2 添加物質(zhì)對種子菌固體發(fā)酵形成芽孢的影響

2.2.1 碳源的影響 向麥麩為底物的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.0%碳源，對種子菌芽孢形成的影響見圖2。結(jié)果表明葡萄糖、麥芽糖、淀粉和乳糖對芽孢的生產(chǎn)有較大影響。考慮到添加碳源物質(zhì)的成本、溶解性和保存的特點，試驗最終選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

2.2.2 氮源的影響 向麥麩為底物的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.0%氮源，對種子菌芽孢形成的影響見圖3。數(shù)據(jù)顯示有機物蛋白氮源(蛋白胨、酵母粉和豆餅粉)比無機物蛋白氮源(硫酸銨、氯化銨和硝酸鈉)固體發(fā)酵形成芽孢的效果好。其中的蛋白胨形成芽胞的量最多，影響最明顯。加上蛋白胨具有購買方便、價格較低、容易保存等特點，因此選擇它作為發(fā)酵培養(yǎng)基的基本的氮源。

圖1 不同底物固體發(fā)酵形成芽孢效果Fig.1 The effects of different substrates on spore production of B. coagulans using SSF

圖2 碳源對B. coagulans形成芽孢的影響Fig.2 The effects of various carbon sources on spore production of B. coagulans using SSF

2.2.3 鹽類的影響 菌種在不同鹽分的固體培養(yǎng)基中發(fā)酵，形成芽孢的統(tǒng)計結(jié)果見圖4。與對照組相比，KH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4和NaH2PO4對芽孢的形成均有不同程度地促進作用，這一特征與文獻9的報道相符，其中的KH2PO4鹽促進產(chǎn)生芽孢的作用最明顯，是對照組的兩倍多。此外，錳鹽對菌種固體發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的影響也比較明顯，表明Mn2+對芽孢的形成起到一定的促進作用，這一結(jié)果與相關(guān)文獻描述的一致[10,11]。值得一提的是硫酸錳比氯化錳固體發(fā)酵促進芽孢的產(chǎn)生的效果明顯，這可能是硫酸錳在提供錳鹽的同時，還補充硫元素用于細菌的生長繁殖?；贙H2PO4和MnSO4對芽孢形成的促進作用，因此選擇這兩種物質(zhì)作為緩沖物和金屬鹽用于固體發(fā)酵。

圖3 氮源對B. coagulans形成芽孢的影響Fig.3 The effects of various nitrogens sources on spore production of B. coagulans using SSF

圖4 濕度對B. coagulans固體發(fā)酵形成芽孢的影響Fig.4 The effects of various moisture content on spore production of B. coagulans using SSF

2.3 濕度對菌種固體發(fā)酵形成芽孢的影響

菌種在不同濕度的麥麩固體培養(yǎng)基中發(fā)酵，形成芽孢的統(tǒng)計結(jié)果見圖5。結(jié)果表明：濕度對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生芽孢的影響特別明顯，促進芽孢形成的濕度范圍特別窄，只有大約在60～65%之間時，發(fā)酵產(chǎn)物中芽孢的量最多。推測可能是：在此濕度范圍內(nèi)，細菌的通氣和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化達到最佳平衡，繁殖產(chǎn)生大量細菌，消耗了較多的養(yǎng)分，促進了芽孢形成。因此，實驗選擇濕度為60%時用于固體發(fā)酵。

2.4 pH對菌種固體發(fā)酵形成芽孢的影響

菌種在不同初始pH的固體培養(yǎng)基中發(fā)酵，形成芽孢的統(tǒng)計結(jié)果見圖6。由圖可知固體基質(zhì)在pH7.0～pH9.5的范圍內(nèi)，都有較好的形成芽孢的效果，說明種子菌適應(yīng)pH的范圍較寬，pH變化對固態(tài)發(fā)酵形成芽孢的影響不明顯。鑒于固體培養(yǎng)基初始值為pH7.5時，產(chǎn)生的芽孢數(shù)為最高。因此確定培養(yǎng)基最適初始值為pH7.5。

圖5 磷酸鹽和錳離子固體發(fā)酵形成芽孢影響Fig.5 The effects of phosphate and manganese salt on spore production of B. coagulans using SSF

圖6 pH值對B.coagulans菌株固體發(fā)酵的影響Fig.6 The effects of substrate various pH on spore production of B. coagulans using SSF

2.5 固體發(fā)酵生產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基優(yōu)化

根據(jù)單因素固體發(fā)酵的試驗結(jié)果，為提高種子菌在固體發(fā)酵時促進芽胞形成的效率，以麥麩為底物，濕度為60%，初始pH7.5，選擇添加葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、磷酸二氫鉀為緩沖物質(zhì)和硫酸錳為促進芽胞形成刺激因子，設(shè)計了L9(34)正交組合下的固體發(fā)酵實驗，各試驗所得的數(shù)據(jù)見表2。分析實驗的結(jié)果，表明影響種子菌固體發(fā)酵芽孢形成的主次因素為D>A>C>B，綜合分析確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比為A1B3C2D1。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test

注：添加物濃度的單位為克/千克，芽孢數(shù)表示三次測定值的平均值及標準差。Xi：表示在i水平下芽孢數(shù)的平均值。R：表示極差值。

Note：the unit of the additive concentration is g/kg, the spores represent the mean value and the standard deviation of three measurements. Xi: represents the average of spores at level i . R: represents the sum of deviation squares.

2.6 優(yōu)化的固體培養(yǎng)基促進芽孢形成的驗證

向優(yōu)化組合(A1B3C2D1)和空白(水)的固體培養(yǎng)基中添加等量的種子菌液，進行固體發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)低溫烘干粉碎，芽胞計數(shù)。結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量可以達3.80×1010個/g以上，明顯高于對照組2.98×109個/g，表明此優(yōu)化組合的發(fā)酵培養(yǎng)基能夠大量提高B. coagulansCQ1的菌體數(shù)，進而提高了芽胞的形成。

3 討 論

芽孢是芽孢形成菌在生長過程中于細胞內(nèi)形成一個圓形或橢圓形的抗逆性休眠體[12]，一般認為芽孢的形成源于缺乏外源營養(yǎng)物質(zhì)，特別是碳源、氮源或磷酸鹽的不足[13]。此外，一些研究還表明固態(tài)介質(zhì)能促進芽孢形成，而且芽孢的形成與菌體所處的介面密切相關(guān)[14]，我們在用凝結(jié)芽胞桿菌固體發(fā)酵生產(chǎn)芽孢制劑時，芽孢的產(chǎn)率受底物的物理和化學特質(zhì)的影響十分明顯，實驗進一步證實固態(tài)介質(zhì)影響的芽孢形成。在不添加任何營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，麥麩是較好的促進芽孢形成的固體介質(zhì)，這可能是固體發(fā)酵時，麥麩本身能夠為菌種提供較好的營養(yǎng)物質(zhì)(因為麥麩的基本構(gòu)成為71%碳源，13%蛋白質(zhì)和16%脂肪，包含少量的維生素和礦物質(zhì)[15])、較適宜的蓬松度以及持續(xù)供氧氣能力的原因。

盡管麥麩有作為營養(yǎng)物質(zhì)的潛力，但凝結(jié)芽胞桿菌單獨利用其生長繁殖還是存在很大局限性。所以當在固體底物麥麩之中添加適量的外源營養(yǎng)物質(zhì)后，發(fā)酵條件通過優(yōu)化組合，經(jīng)生物發(fā)酵驗證，固體發(fā)酵產(chǎn)物中的芽孢產(chǎn)率明顯上升。這說明添加的外源成分促發(fā)了細菌大量生長繁殖，同時產(chǎn)生了各種代謝物質(zhì)，打碎麥麩形態(tài)，使細菌能夠較好地利用麥麩中的碳源、氮源和一些重要的鹽類物質(zhì)來生長繁殖，擴大細菌菌體的數(shù)量，進而提高了芽孢的產(chǎn)量。

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