■劉明珠 瞿明仁 包淋斌 鄔向東 鐘啟平

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省高校動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045；2.江西宜春強(qiáng)微生物科技有限公司，江西宜春 336000）

微生態(tài)制劑以其天然、無毒、無副作用、無殘留、安全可靠、不污染環(huán)境的優(yōu)越性成為發(fā)展綠色畜禽產(chǎn)品和替代抗生素首推的飼料添加劑之一。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定可用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的微生物有6種,即乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、糞腸球菌 、芽孢桿菌、雙歧桿菌和酵母菌[1]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)乳酸糞腸球菌對天然牛瘤胃液耐受性比較強(qiáng)，處理3 h，存活仍有95%以上（瞿明仁等，2012）[2]。大量研究證明,科學(xué)的復(fù)合制劑對動物有協(xié)同和互補(bǔ)作用。因此，本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，以產(chǎn)乳酸糞腸球菌、酵母菌和芽孢桿菌（地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌）為主，配制了4種復(fù)合益生菌。本研究利用體外培養(yǎng)的方法，評定4種復(fù)合益生菌制劑對江西錦江黃牛瘤胃體外發(fā)酵培養(yǎng)的影響，以期篩選出最佳的復(fù)合益生菌組合，為在肉牛中的生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)合益生菌由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與宜春強(qiáng)微生物科技有限公司聯(lián)合研制和生產(chǎn)，代號分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，共4種。復(fù)合益生菌由產(chǎn)乳酸糞腸球菌、酵母菌和芽孢桿菌（地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌）按一定比例和工藝制備而成，見表1。

表1 復(fù)合益生菌組成

1.2 試驗(yàn)動物與基礎(chǔ)日糧

選用2頭體重為(275±15)kg安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛，以供瘤胃液的采集。試驗(yàn)動物每天飼喂2次(08:00和18:00)，自由飲水?；A(chǔ)日糧為玉米-豆粕-稻草型日糧，按肉牛1.3倍維持需要配制，精粗比為60∶40，基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

體外培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)5個(gè)組，即不添復(fù)合益生菌的基礎(chǔ)日糧為對照組，4個(gè)試驗(yàn)組分別添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ號復(fù)合益生菌，添加量均為在基礎(chǔ)日糧中添加200 mg/kg。

1.3 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1 體外培養(yǎng)裝置

體外批次培養(yǎng)裝置參照盧德勛等[3]和程茂基[4]的方法進(jìn)行。該裝置主體為恒溫水浴搖床，其水浴溫度和震蕩速率可調(diào)。培養(yǎng)瓶為瓶口安裝有橡皮塞的150 ml奶瓶，橡皮塞上接有帶三通閥的橡膠管，三通閥可打開和關(guān)閉，三通閥一端與25 ml醫(yī)用玻璃注射器相連，注射器用于測定體外培養(yǎng)過程中的產(chǎn)氣量。

1.3.2 瘤胃液采集

于晨飼前由2頭錦江黃牛瘤胃內(nèi)上下左右(背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊)不同位點(diǎn)采集足量瘤胃液，灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的滅菌清潔燒杯中，燒杯置于裝有39℃蒸餾水的保溫瓶中，灌滿后立即蓋好保溫瓶蓋子，迅速返回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過濾后持續(xù)通入CO2氣體5 min，然后迅速分裝至已預(yù)熱好并裝有培養(yǎng)底物和人工唾液的培養(yǎng)瓶內(nèi)(每個(gè)培養(yǎng)瓶加20 ml瘤胃液)。接通培養(yǎng)瓶和注射器，打開振蕩開關(guān)，開始培養(yǎng)。

1.4 樣品的預(yù)處理

培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)瓶取出，立即測定其pH值，然后將培養(yǎng)物用紗布過濾，濾渣無損失地轉(zhuǎn)移入100 ml大坩堝中，置于65℃烘箱中烘干，以測定干物質(zhì)降解率。濾液轉(zhuǎn)移至100 ml大離心管中，以1 500 r/min離心15 min，去除原蟲和飼料大顆粒。取上清液保存，以備分析BCP濃度、NH3-N濃度和VFA濃度。

1.5 指標(biāo)的測定

1.5.1 產(chǎn)氣量

每隔30 min記錄注射器的氣體量，記錄完后排氣，累計(jì)培養(yǎng)24 h的總產(chǎn)氣量。

1.5.2 瘤胃液pH值

培養(yǎng)24 h后立即用PHS-320酸度計(jì)（上海密通機(jī)電科技有限公司生產(chǎn)）直接測定。

1.5.3 瘤胃液NH3-N濃度

參照馮宗慈等的比色法進(jìn)行測定[5]。

1.5.4 瘤胃液菌體蛋白（MCP）的測定

取經(jīng)預(yù)處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液10 ml，以16 000×g離心20 min，棄去上清液，沉淀的細(xì)菌部分加入9 ml、10%三氯乙酸溶液，混勻，再以4 000 r/min離心10 min，取沉淀物加入5%氫氧化鈉溶解，然后稀釋至25 ml。此稀釋液又經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液在紫外分光光度計(jì)上用280 nm和260 nm波長進(jìn)行比色。應(yīng)用下面公式求得細(xì)菌蛋白質(zhì)含量：

細(xì)菌蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=(1.45×D280-0.74×D260)×稀釋倍數(shù)

1.5.5 瘤胃液VFA濃度

按照戈婷婷等[6]的氣相色譜法進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和Spss16.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)合益生菌體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量、pH值、

MCP含量、NH3-N濃度和干物質(zhì)降解率

表3 不同復(fù)合益生菌制劑對培養(yǎng)液產(chǎn)氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質(zhì)降解率影響

由表3可見，添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號復(fù)合益生菌和對照組的培養(yǎng)液pH值均在正常范圍內(nèi)。添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌的24 h總產(chǎn)氣量與對照組有顯著的提高(P＜0.05)，各處理組間差異不顯著(P＞0.05),但以Ⅱ號復(fù)合益生菌的產(chǎn)氣量最高為170.50 ml；Ⅰ、Ⅱ號復(fù)合益生菌微生物蛋白含量極顯著高于其他組(P＜0.01)，其中Ⅱ號復(fù)合益生菌的微生物蛋白含量最高達(dá)270.43 mg/100 ml，而且顯著高于Ⅰ、Ⅲ號(P＜0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌氨態(tài)氮濃度極顯著低于對照組和第Ⅳ號復(fù)合益生菌(P＜0.01)，Ⅳ號復(fù)合益生菌顯著低于對照組(P＜0.05)；Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌干物質(zhì)降解率極顯著高于對照組(P＜0.01)。

2.2 不同復(fù)合益生菌制劑對瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響（見表4）

表4 添加不同復(fù)合益生菌對瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

由表4可見，與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌的乙酸和丁酸濃度顯著高于對照組和Ⅳ號復(fù)合益生菌（P＜0.05），丙酸和總VFA濃度極顯著高于對照組（P＜0.01），乙酸/丙酸值極顯著低于對照組和Ⅳ復(fù)合益生菌（P＜0.01），而Ⅳ號復(fù)合益生菌揮發(fā)酸濃度雖比對照組高一些但差異不顯著（P＞0.05）。各處理組之間比較，Ⅱ號丙酸濃度為52.08 mmol/l顯著高于Ⅰ號（P＜0.05），Ⅰ號和Ⅲ號差異不顯著（(P＞0.05）；Ⅱ號總揮發(fā)性脂肪酸濃度最高，但是處理組間差異不顯著（P＞0.05），Ⅱ、Ⅲ號的乙酸/丙酸值顯著低于Ⅰ號（P＜0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的影響

瘤胃pH值是評價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定的基本指標(biāo),它主要受唾液、飼糧及瘤胃微生物區(qū)系的影響。本試驗(yàn)體外培養(yǎng)24 h后各組瘤胃液pH值都較低，這可能是由于本試驗(yàn)的精粗比為6∶4比較高，體外培養(yǎng)試驗(yàn)不能像體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)菢?，將微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸吸收、排出或中和，再加上，使得產(chǎn)生的酸一直在培養(yǎng)瓶中蓄積，導(dǎo)致pH值較低。但各組pH值與對照組無顯著差異，說明添加4種復(fù)合益生菌沒有破壞瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。姜艷美等[7]研究發(fā)現(xiàn)添加釀酒酵母菌對人工瘤胃酸堿內(nèi)環(huán)境沒有造成不良影響，瘤胃pH值差異不顯著,劉彩娟等[8]通過飼養(yǎng)試驗(yàn)表明添加復(fù)合益生菌對奶牛瘤胃pH值影響不顯著(P＜0.05)這些研究結(jié)果與本研究一致，說明使用復(fù)合益生菌不影響瘤胃pH值,而且可能對瘤胃內(nèi)環(huán)境具有穩(wěn)定作用，促進(jìn)瘤胃微生物在良好的瘤胃環(huán)境下生長繁殖。

3.2 復(fù)合益生菌對瘤胃發(fā)酵功能的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合益生菌24 h總產(chǎn)氣量與對照組有顯著的提高(P＜0.05)，說明添加復(fù)合益生菌后，瘤胃微生物生長繁殖旺盛。而且Ⅰ、Ⅱ號復(fù)合益生菌微生物蛋白含量極顯著高于對照組(P＜0.01)，其中Ⅱ號復(fù)合益生菌的微生物蛋白含量最高達(dá)270.43 mg/100 ml；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ復(fù)合益生菌氨態(tài)氮濃度極顯著低于對照組(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌干物質(zhì)降解率極顯著高于對照組(P＜0.01)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌的丙酸和總VFA濃度極顯著高于對照組(P＜0.01)，乙酸/丙酸值極顯著低于對照組(P＜0.01)，Beauchemin 等[9]報(bào)道,給育肥牛飼喂糞腸球菌能夠提高瘤胃丙酸的濃度。Miller-Webster[10]認(rèn)為,高濃度的VFA,尤其是高濃度的丙酸可保證牛奶中乳糖含量。Harrison報(bào)道,酵母培養(yǎng)基添加于荷斯坦乳牛的日糧中,使瘤胃內(nèi)乙酸、乙酸與丙酸比例降低。楊朋飛（2009）[11]研究表明：奶牛每天飼喂5 g BLCS微生態(tài)制劑可改善奶牛瘤胃發(fā)酵功能,顯著降低瘤胃內(nèi)NH3-N濃度,提高菌體蛋白(BCP)、乙酸、丙酸與總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度，這與本研究結(jié)果一致，說明瘤胃發(fā)酵功能得到了改善。

3.3 復(fù)合益生菌組成對瘤胃發(fā)酵功能影響及適宜組成

易維學(xué)(2010)[12]研究表明糞腸球菌和枯草芽孢桿菌均可較好的抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長；糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌可以起到較好的促生長作用。范利霞（2010）[13]研究表明,乳酸菌、芽孢桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸及其代謝產(chǎn)物對一些病原菌有抑制作用,并能激活免疫活性細(xì)胞,增強(qiáng)機(jī)體免疫力;酵母培養(yǎng)物營養(yǎng)豐富,可促進(jìn)有益菌的生長、抑制病原菌的繁殖,提高機(jī)體免疫能力,并對防治畜禽消化道系統(tǒng)疾病起到有益作用。本課題組研制的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號復(fù)合益生菌是以酵母菌、乳酸糞腸球菌、芽孢桿菌復(fù)配而成的。本課題組研制的4種復(fù)合益生菌對瘤胃內(nèi)環(huán)境具有穩(wěn)定作用，同時(shí)改善了瘤胃發(fā)酵功能是與酵母菌、乳酸糞腸球菌、芽孢桿菌等3種微生物特性和功能相符合的。從研究結(jié)果來看，以Ⅱ號復(fù)合益生菌效果最佳，但最佳添加量有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①添加復(fù)合益生菌能夠穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵功能改善。

②以Ⅱ號復(fù)合益生菌效果最佳，但最佳添加量和體內(nèi)效果有待進(jìn)一步研究。