■朱立鑫 石枬弘
(全能生物科技(天津)有限公司,天津 301600)
豬只生產(chǎn)中的仔豬是飼養(yǎng)關(guān)鍵期,易消化失調(diào)造成生長(zhǎng)遲緩,由于仔豬腹瀉的發(fā)生與飼料蛋白質(zhì)源有關(guān)(Pluske等,1995)。豆粉(soybean meal,SBM)是提供豬只蛋白質(zhì)的主要來(lái)源,然而豆粉含有多種的抗?fàn)I養(yǎng)因子(antinutrition factors,ANFs),例如胰蛋白酶抑制因子(trypsin inhibitor,TI)、凝集素(lectins)和大豆球蛋白(soybean globulins)等,干擾養(yǎng)分的消化、吸收和利用,對(duì)仔畜生長(zhǎng)性能影響甚大(Dunsford等,1989;Jiang等,2000)。過(guò)去報(bào)告指出 TI會(huì)降低蛋白質(zhì)的消化率和造成胰臟肥大(Liener,1981)。另外造成過(guò)敏反應(yīng)的大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin則會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸道異常表現(xiàn)(Stokes等,1984;Miller等,1986)。
利用微生物發(fā)酵技術(shù)降低ANFs可改善豆粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,有助于動(dòng)物消化利用。傳統(tǒng)上利用Aspergillus oryzae以制作醬油、清酒和味精等食品,也可應(yīng)用于飼料豆粉的發(fā)酵以降低豆粉內(nèi)的TI和增加小分子勝肽的含量,報(bào)告指出可改善雞只生長(zhǎng)和飼料利用率(Chah等,1975;Hong等,2004)。
日本的納豆、越南的thua-nao和西非的dawadawa是使用Bacillus subtilis發(fā)酵的食品,Bacillus subtilis因具有大量水解蛋白質(zhì)成氨基酸和肽的特性(Sarkar和Tamang,1995),故大量利用Bacillus subtilis發(fā)酵豆粉可促進(jìn)豬只飼料消化率(Sarkar等,1997;Kiers等,2000),改善體增重及飼料效率(Kiers等,2003)。Rhizopus spp.用于制作印度尼西亞傳統(tǒng)黃豆發(fā)酵食品Tempe,發(fā)酵過(guò)程為合成酵素以水解蛋白質(zhì),降低抗?fàn)I養(yǎng)因子和產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味(Mital等,1990)。
豆粉經(jīng)由發(fā)酵可降低抗?fàn)I養(yǎng)因子,有助于仔畜對(duì)蛋白質(zhì)消化及吸收,改善體增重與飼料效率,本試驗(yàn)使用Lactobacillus spp.菌種發(fā)酵豆粉,飼料中添加10%發(fā)酵豆粉,取代部分豆粉、魚粉和乳清粉,評(píng)估對(duì)離乳仔豬生長(zhǎng)、腸道發(fā)育及免疫反應(yīng)之影響。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為24只三周齡二元種豬(Landrace×Yorkshire),隨機(jī)分成3個(gè)處理組,分別為對(duì)照組(CTRL)、乳酸菌+酵母菌+芽孢桿菌復(fù)合菌發(fā)酵豆粕處理組(TRT2D)及乳酸菌發(fā)酵+熟化工藝處理發(fā)酵豆粕處理組(TRT1N),每處理組2個(gè)重復(fù),每重復(fù)4只,分別為對(duì)照組及兩種發(fā)酵豆粉試驗(yàn)組,發(fā)酵豆粉試驗(yàn)組是以發(fā)酵豆粉取代部分豆粉、魚粉和乳清粉作為飼料蛋白質(zhì)主要來(lái)源(見(jiàn)表1)。試驗(yàn)進(jìn)行3周,每周記錄體增重和采食量。飼養(yǎng)期結(jié)束,每重復(fù)組取2只豬收集糞便和采血,麻醉方式犧牲,取胃至結(jié)腸食糜檢測(cè)pH值,收集的小腸分三段儲(chǔ)存于10%福爾馬林,脾臟組織于4℃保存,以評(píng)估對(duì)生長(zhǎng)性能、腸道菌群、腸道形態(tài)與免疫功能的影響。
飼養(yǎng)期為3周,每周稱量豬只體重與飼料重,評(píng)估增重、飼料采食量及飼料效率。
取胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸腔內(nèi)食糜,測(cè)定各腸段食糜pH值,將食糜保存于-20℃待菌相檢驗(yàn)。取2 g檢體加入20 ml稀釋液,加入沸石數(shù)粒,振蕩混合,作為原液,以100 μl原液+900 μl稀釋液的方式,稀釋至所需的稀釋倍數(shù)。將培養(yǎng)基劃分為三區(qū),取50 μl的稀釋液到對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的一區(qū),以L棒涂抹,培養(yǎng)37℃及24~48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)目。
表1 飼料配方
收集糞便保存于5~8℃,24 h內(nèi)檢驗(yàn)。取2 g檢體加入20 ml稀釋液,加入沸石數(shù)粒,振蕩混合,作為原液,以100 μl原液+900 μl稀釋液的方式,稀釋至所需的稀釋倍數(shù)。將培養(yǎng)基劃分為三區(qū),取50 μl的稀釋液到對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的一區(qū),以L棒涂抹,培養(yǎng)37℃及24~48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)目。
將十二指腸、空腸和回腸各取1~2 cm于10%福爾馬林中固定一周,修整厚度至2~4 mm,以95%酒精脫水1 h,脫水后再將組織浸泡于二甲苯中加以清洗,經(jīng)石蠟包埋及脫蠟后以蘇木精與伊紅染色法染色,再以顯微鏡觀察切片結(jié)果,測(cè)量絨毛高度和腺窩深度。
脾臟淋巴細(xì)胞離心分離并純化后,將細(xì)胞調(diào)整至1×106個(gè)/ml。將此淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清且不含麩酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)液中。淋巴細(xì)胞的增生反應(yīng)能力測(cè)定為利用微量盤法,每孔含1×105個(gè)細(xì)胞,每一處理為3個(gè)重復(fù),培養(yǎng)于37 ℃與5%CO2培養(yǎng)箱中,并分別添加10 μg/ml的伴刀豆球蛋白及LPS(concanavalin A,con A;lipopolysaccharide;LPS),刺激48 h后添加10 μg/ml3H-胸腺嘧啶(specific activity 80 Ci/mmol,Amersham Pharmacia Biotech.)共同培養(yǎng)18 h后,測(cè)定各處理cpm值/對(duì)照組未經(jīng)裂殖原刺激cpm值,以計(jì)算其增生指數(shù)(SI)。
將血液放于添加肝素真空采血管,于4℃靜置12 h,收集上清液存于-20℃保存待IgA和IgG分析。使用Pig IgA/IgG ELISA Quantitation Set套組(Level Biotechnology Inc.BTLE100-102/104),首先將第一抗體(coating antibody)固定于96-well盤,培養(yǎng)1 h后以ELISA wash solution清洗3次,再加入blocking solution培養(yǎng)30 min,再清洗3次后每well加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,于室溫培養(yǎng)1 h,再清洗3次后加入第二抗體(HRP detection antibody)培養(yǎng)1 h,清洗后加入第二抗體呈色劑(TMB substrate solution),于室溫避光下反應(yīng)8~10 min,再加入stop solution以停止反應(yīng),于450 nm測(cè)定吸光值。
血液收集于真空采血管,于4℃靜置12 h,以1 200×g離心10 min,收集上清液使用豬瘟(Hog Cholera,HC)ELISA分析法,利用HC酵素結(jié)合體與檢體中HC抗體同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)固定在微孔盤上的HC抗原原理,因此檢體中HC抗體含量愈高,酵素反應(yīng)呈色將降低,若是檢體中無(wú)HC抗體,則酵素反應(yīng)呈色將變深。方法為取50 μl Sample Diluent依所需的樣本數(shù)加入IDEXX ELISA KIT CSFV測(cè)試盤,分別取50 μl陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和血清樣本依序加入測(cè)試盤,于室溫下靜置反應(yīng)120 min。倒掉測(cè)試盤中的液體,以350 μl的10×稀釋wash buffer洗滌測(cè)試盤3~5次。除去孔中殘留的清洗液,在每一個(gè)測(cè)試孔中加入100 μl Anti-CSFV:HRPO Conjugate,于室溫下靜置反應(yīng)30 min。再清洗3~5次后于每一個(gè)測(cè)試孔中加入100 μl TMB Substrate Solution反應(yīng)10 min,再加入stop solution以停止反應(yīng),于450 nm測(cè)定吸光值。
先經(jīng)一般線性模式GLM(general linear models)行變方分析,再以鄧肯氏新多次變域測(cè)定法(Duncan‘s new multiple range test)比較各處理組的差異顯著性。
由表2可見(jiàn),試驗(yàn)組之間在各周的飼養(yǎng)下對(duì)豬只體平均日增重和平均日采食量無(wú)顯著的差異,不過(guò) TRT1N組在飼養(yǎng)第三周較其它兩試驗(yàn)組有較大的增重幅度。飼料效率方面,試驗(yàn)組之間在飼養(yǎng)的第一周和第二周對(duì)豬只飼料效率無(wú)顯著差異,不過(guò)TRT1N組在飼養(yǎng)第二周比其它兩組有較佳飼料效率的趨勢(shì)。在飼養(yǎng)的第三周,TRT1N組顯著低于對(duì)照組有較佳的飼料效率表現(xiàn)。
表2 發(fā)酵豆粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響
探討發(fā)酵豆粉對(duì)離乳仔豬胃到結(jié)腸的消化道食糜的pH值和菌相的影響。表3為仔豬測(cè)量消化道pH值結(jié)果。胃的部分在TRT2D組處理下,pH值顯著高于對(duì)照組,而TRT1N組與其他兩試驗(yàn)組比較無(wú)顯著差異。十二指腸至結(jié)腸的食糜pH值在三個(gè)試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異。
表3 發(fā)酵豆粉對(duì)離乳仔豬消化道pH值的影響
表4為檢測(cè)腸內(nèi)大腸桿菌、沙門氏桿菌、梭菌和乳酸菌的結(jié)果。大腸桿菌量在兩組發(fā)酵豆粉處理下,可在盲腸之外的腸腔發(fā)現(xiàn),而在結(jié)腸部位,TRT2D組的大腸桿菌量顯著多于TRT1N組。盲腸和結(jié)腸內(nèi)的沙門氏桿菌量在各試驗(yàn)組處理下無(wú)顯著差異。梭菌部分只在TRT1N組的胃至結(jié)腸內(nèi)檢測(cè)到含量。盲腸內(nèi)的乳酸菌量在兩組發(fā)酵豆粉影響下顯著減少,而回腸和結(jié)腸的乳酸菌量在三個(gè)試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異。
表4 發(fā)酵豆粉對(duì)離乳仔豬消化道菌相的影響(log10)
分析仔豬糞便內(nèi)的大腸桿菌、沙門氏桿菌、梭菌和乳酸菌的菌數(shù)(見(jiàn)表5)。大腸桿菌量在發(fā)酵豆粉兩組處理下顯著低于對(duì)照組,而兩組發(fā)酵豆粉之間無(wú)顯著的差異。沙門氏桿菌和乳酸菌在三個(gè)試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異。梭菌均無(wú)檢測(cè)。
表5 發(fā)酵豆粉對(duì)斷奶仔豬糞便菌相的影響(log10)
表6 發(fā)酵豆粉對(duì)斷奶仔豬小腸絨毛的影響
由表6可見(jiàn),十二指腸和回腸三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)絨毛長(zhǎng)度和腺窩深度無(wú)顯著差異,然而空腸部分,TRT2D組和TRT1N組顯著降低腺窩深度。另外空腸和回腸三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)絨毛和腺窩比值無(wú)顯著差異,而TRT1N組比其它兩組顯著增加十二指脂絨毛和腺窩比值。
以ConA和LPS分別誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞,如表7所示,經(jīng)由ConA刺激,TRT2D組比對(duì)照組顯著降低T淋巴細(xì)胞增生反應(yīng),而TRT1N組與其他兩試驗(yàn)組比較無(wú)顯著差異。以LPS刺激則兩個(gè)發(fā)酵豆粉組比對(duì)照組顯著降低B淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)。
表7 發(fā)酵豆粉對(duì)斷奶仔豬脾臟淋巴細(xì)胞增生的影響
由表8可見(jiàn),三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)IgA和IgG濃度呈現(xiàn)無(wú)顯著差異,不過(guò)TRT2D組對(duì)IgG濃度有增加的趨勢(shì)。
表8 發(fā)酵豆粉對(duì)斷奶仔豬血液免疫球蛋白濃度與HC抗體力價(jià)的影響
豬瘟抗體力價(jià)范圍在45以下為不具保護(hù)能力,46~89為具保護(hù)能力,90以上則抗體偏高。本試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果如表8所示,三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)仔豬HC抗體力價(jià)無(wú)顯著差異,且已不具保護(hù)能力。另外分析C-reactive protein結(jié)果均無(wú)法偵測(cè)到。
過(guò)去的研究指出豆粉內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子(ANFs)如胰蛋白酶抑制因子(TI)、大豆球蛋白等,影響仔豬腸道形態(tài)和養(yǎng)分消化,利用微生物發(fā)酵過(guò)程中可降低ANFs以改善豆粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,利于動(dòng)物消化利用(Matsuo,2006)。本試驗(yàn)結(jié)果表2所示,發(fā)酵豆粉顯著改善仔豬生長(zhǎng)性能,而其中TRT1N組則有較佳的飼料效率表現(xiàn),與Kim等(2005)報(bào)告指出具有相似的生長(zhǎng)促進(jìn)效果,他們發(fā)現(xiàn)飼料內(nèi)使用5%發(fā)酵豆粉(Aspergillus oryzae發(fā)酵)比對(duì)照組有顯著的提升豬只平均日增重和飼料轉(zhuǎn)換率。Zamora和Veum(1979)也指出大豆經(jīng)由Aspergillus oryzae發(fā)酵可改善豬只生長(zhǎng)性能。
營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要在胃和前端腸道大量被消化和吸收,后段及大腸內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量就會(huì)在有限的數(shù)量范圍內(nèi)繁殖,若不能被有效的消化吸收,將導(dǎo)致后段和大腸內(nèi)細(xì)菌滋生,且仔豬離乳易受到Escherichia coli感染而致生長(zhǎng)不良和腹瀉,過(guò)去報(bào)告指出發(fā)酵大豆喂飼兔子可抑制E.coli感染和減少仔豬感染E.coli造成腸道液體的流失(Karyadi等,1990)。所以限制離乳仔豬腹瀉的最好辦法為提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率,特別是含蛋白質(zhì)類,豆粉可經(jīng)由發(fā)酵增加小勝肽片段含量,減少大分子的抗?fàn)I養(yǎng)因子,促進(jìn)動(dòng)物消化與利用(Hong等,2004),減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在后端腸道內(nèi)的總量。本試驗(yàn)測(cè)定仔豬消化道內(nèi)食糜pH值,文獻(xiàn)指出發(fā)酵過(guò)程抑制豆粉內(nèi)胰蛋白酶抑制因子,改善離乳仔豬腸道的消化酶活性(Feng等,2007),而腸道消化酶需要胃中鹽酸的激活,本試驗(yàn)結(jié)果在TRT2D組處理下,胃中pH值顯著高于對(duì)照組,而TRT1N組與其他兩試驗(yàn)組比較胃的pH值無(wú)顯著差異(見(jiàn)表3)。兩種發(fā)酵豆粉對(duì)胃的pH值影響不同,推測(cè)TRT1N組對(duì)腸內(nèi)消化酶活性有增加促進(jìn)的可能。
而腸內(nèi)與糞便菌相檢測(cè)結(jié)果如表4和表5所示,在結(jié)腸部位,TRT2D組的大腸桿菌量顯著多于TRT1N組,盲腸和結(jié)腸內(nèi)的沙門氏桿菌量在各試驗(yàn)組處理下無(wú)顯著差異,盲腸內(nèi)的乳酸菌量在兩組發(fā)酵豆粉影響下顯著減少,梭菌部分只在TRT1N組的胃至結(jié)腸內(nèi)檢測(cè)到含量。分析仔豬糞便內(nèi)大腸桿菌量在發(fā)酵豆粉兩組處理下顯著低于對(duì)照組。沙門氏桿菌和乳酸菌在三個(gè)試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異。梭菌部分三組全無(wú)檢測(cè)結(jié)果。從上述食糜與糞便菌相檢測(cè)結(jié)果推測(cè)發(fā)酵豆粉對(duì)腸內(nèi)壞菌抑制效果不佳,也對(duì)乳酸菌群無(wú)生長(zhǎng)促進(jìn)效果。
胰蛋白酶抑制因子會(huì)干擾胰蛋白酶和胰凝乳酶作用,導(dǎo)致異常的腸道形態(tài)(Liener等,1980)。Zarkadas和Wiseman(2007a、b)提出豆粉內(nèi)的TI與仔豬腸道絨毛長(zhǎng)度呈負(fù)相關(guān)。仔豬離乳后會(huì)受到飼料內(nèi)豆粉的抗原成分造成短暫性過(guò)敏反應(yīng),影響仔豬腸道形態(tài)的變化(Miller等,1994),與絨毛萎縮、腺窩細(xì)胞分裂、腺窩增生有關(guān),產(chǎn)生吸收不良癥狀(Kenworthy等,1996)。本試驗(yàn)的三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)十二指腸和回腸的絨毛長(zhǎng)度和腺窩深度無(wú)顯著差異,然而空腸部分,TRT2D組和TRT1N組顯著降低腺窩深度。另外空腸和回腸于三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)絨毛和腺窩比值圖無(wú)顯著差異,而TRT1N組比其它兩組顯著增加十二指腸的絨毛和腺窩比值(見(jiàn)表6)。十二指腸主要功能是分泌黏液、刺激胰消化酶和膽汁的分泌,為蛋白質(zhì)的重要消化場(chǎng)所;空腸、回腸的主要功能是吸收,因此絨毛健全是很重要的。絨毛的腸細(xì)胞是由未分化的腺窩細(xì)胞所生成的。在腺窩(crypt),腸細(xì)胞主分泌功能,當(dāng)其漸漸的往絨毛前端移動(dòng)時(shí),可發(fā)育成熟而成為吸收性絨毛細(xì)胞(absorptive villus cell),即微絨毛會(huì)變得長(zhǎng)、薄且多,以及消化酵素的生成。因此,如果絨毛尖端受損。則其成熟的吸收細(xì)胞會(huì)流失,最后結(jié)果則只有分泌作用而已。若腺窩細(xì)胞過(guò)度分裂則腺窩深度增加,造成黏液分泌增加,使得仔豬發(fā)生腹瀉情形。
Liu等(2007)進(jìn)行仔豬喂飼發(fā)酵豆粉的試驗(yàn),顯示經(jīng)由ConA和LPS誘導(dǎo),能顯著降低脾臟淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)。結(jié)果和本試驗(yàn)相符,如表7所示,經(jīng)由ConA刺激,TRT2D組比對(duì)照組顯著降低T淋巴細(xì)胞增生反應(yīng),而TRT1N組與其他兩試驗(yàn)組比較無(wú)顯著差異。以LPS刺激則兩個(gè)發(fā)酵豆粉組比對(duì)照組顯著降低B淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)。過(guò)去報(bào)告指出,提供仔豬豆粉則誘發(fā)較大的周邊淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Li等,1990)。淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)降低可能與大豆抗原球蛋白因發(fā)酵而降解有關(guān),以減少抗原物質(zhì)過(guò)度刺激免疫系統(tǒng)。Hong等(2004)提到使用Aspergillus oryzae發(fā)酵的豆粉可減少大分子勝肽含量(>60 kD),而顯著增加小分子勝肽量(<20 kD)。
Li等(1990)試驗(yàn)結(jié)果為喂飼豬只豆粉則會(huì)提高IgG抗體濃度。原因?yàn)槭趁又械拇蠖箍乖鞍祝╣lycinin和β-conglycinin)會(huì)經(jīng)由腸內(nèi)腸細(xì)胞間隙進(jìn)入血液,刺激全身免疫系統(tǒng)而增加IgG抗體表現(xiàn)。本試驗(yàn)免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果為在三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)IgA和IgG濃度呈現(xiàn)無(wú)顯著差異,不過(guò)TRT1N組較對(duì)照組有減少的可能,而TRT2D組對(duì)IgG濃度有增加的趨勢(shì)(見(jiàn)表8)。推測(cè)TRT1N組的發(fā)酵豆粉經(jīng)過(guò)較佳的發(fā)酵作用以減少抗原成分。
C-reactive protein(CRP)由肝臟分泌,傷口或病原感染時(shí)會(huì)迅速上升,與白血球吞噬作用、免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)有關(guān),測(cè)定結(jié)果得知豬只未受病原感染。另外檢測(cè)豬瘟抗體力價(jià),本試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果如表8所示,三個(gè)試驗(yàn)組對(duì)仔豬HC抗體力價(jià)無(wú)顯著差異,且已不具保護(hù)能力。
本試驗(yàn)?zāi)康臑槎狗叟c發(fā)酵豆粉作比較,也探討兩種發(fā)酵豆粉產(chǎn)品對(duì)離乳仔豬的生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)和免疫特性的影響。TRT1N組則有較佳的飼料效率表現(xiàn)。兩種發(fā)酵豆粉降低胃的pH值影響不顯著,且發(fā)酵豆粉對(duì)腸內(nèi)壞菌抑制效果不明顯,對(duì)乳酸菌群無(wú)較佳的促進(jìn)效果。TRT2D組和TRT1N組均可顯著降低空腸腺窩深度,而TRT1N組可顯著增加十二指腸的絨毛和腺窩比值。兩種發(fā)酵豆粉能降低脾臟淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)和免疫球蛋白濃度,綜合本試驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵豆粉對(duì)豬只生長(zhǎng)性能、絨毛形態(tài)和免疫特性具有正向的效果。