犬細(xì)小病毒(CPV-2)的分子生物學(xué)特性與進(jìn)化

賀 英，潘素敏，楊彩然，張艷英，史秋梅*，邵新華

(1河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600;2河北省欒城縣新華科極獸藥有限公司)

犬細(xì)小病毒病是犬的一種具有高度接觸性的烈性傳染病。臨床特征以急性出血性腸炎和非化膿性心肌炎為特征。犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus，CPV-2)是引起該病的病原微生物，屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科細(xì)小病毒屬自主復(fù)制的單鏈DNA病毒。包括兩個(gè)抗原型和基因型不同的病毒CPV-1型(也稱為犬細(xì)小病毒，minus virus of caine，MVC)和CPV-2型，能夠引發(fā)嚴(yán)重臨床癥狀的主要是CPV-2型。早在1967年，Binn等從犬分離到第一種犬細(xì)小病毒——犬微小病毒(Minute virus of canine，MVC)，后命名為CPV-1型。1977年，美國學(xué)者Eugster和Nairn從患出血性腸炎的病犬糞便中首先觀察到CPV;1978年，澳大利亞的Kelly和加拿大的Thomson等首次從病犬的糞便中分離得到該病毒。為了區(qū)別于CPV-1，該CPV被命名為CPV-2。

1 細(xì)小病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)

1.1 基因組的結(jié)構(gòu)

犬細(xì)小病毒基因組為單鏈線狀DNA，全部基因組包括末端是5 323 nt［1］，目前僅報(bào)道一個(gè)全基因組序列?；蚪Y(jié)構(gòu)包括3'端非編碼區(qū)，兩個(gè)主要的開放讀碼框和5'端的非編碼區(qū)和一個(gè)不知名的蛋白編碼區(qū)。1～271 nt為3'端非編碼區(qū)，272～2 278 nt編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，2 285～4 540 nt編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，4 541～5 323 nt為5'端非編碼區(qū)。CPV僅在3'端有末端重復(fù)序列，全長118 nt，其中92 nt形成莖結(jié)構(gòu)，26 nt形成T結(jié)構(gòu);5'端存在一些正向重復(fù)序列，第一個(gè)重復(fù)序列開始于4 514～4 574 nt，而且越過終止密碼(4 538)，緊接著重復(fù)序列在4 574～4 636 nt，在4 593位有一個(gè)堿基的插入，在4 603位有一個(gè)C-T的逆轉(zhuǎn);另一個(gè)重復(fù)序列開始于4 701 nt，也是62 nt，共有3個(gè)拷貝，結(jié)束于4 886 nt。在最末端還有一個(gè)255個(gè)堿基的編碼序列，該序列是衣殼蛋白編碼序列4 289～4 543 nt的重復(fù)序列，具體功能未知。

1.2 基因組編碼功能蛋白的研究進(jìn)展

1.2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2) 病毒基因組3'端的第一個(gè)開放讀碼框編碼病毒的兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，主要作用是控制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

犬細(xì)小病毒NS1是由272～2 278位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，基因全長2 007 nt，由668個(gè)氨基酸殘基組成。研究以鼠細(xì)小病毒為代表的自主細(xì)小病毒發(fā)現(xiàn)，NS1的主要功能是控制病毒復(fù)制和后代病毒粒子的產(chǎn)生［2，3］。具體包括:ATP結(jié)合、水解作用、同源寡聚化、對同源DNA識別基序的特異性結(jié)合、DNA解旋、位點(diǎn)特異的內(nèi)切酶活性，啟動(dòng)子的反式調(diào)控和與一系列細(xì)胞蛋白的特殊作用［4，5］，因而參與病毒繁殖的全部過程，包括病毒基因組的復(fù)制，調(diào)節(jié)同源和異源基因表達(dá)以引起細(xì)胞病變［6］。NS1的表達(dá)通過細(xì)胞毒性機(jī)制抑制細(xì)胞的各種功能［7］。NS1蛋白翻譯后修飾作用如磷酸化可能對該蛋白的多種活性有影響，磷酸化的NS1能夠啟動(dòng)病毒DNA的復(fù)制［3］。NS1 C端T585的突變對病毒基因組復(fù)制影響不明顯，但可以降低病毒對細(xì)胞的毒性，而S588突變?yōu)锳588卻大大增加了病毒對細(xì)胞的殺傷力，NS1的后期磷酸化也影響病毒粒子的細(xì)胞毒性［2，7］。

NS2是由272～527位核苷酸和2 004～2 278核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，基因全長531 nt，由176個(gè)氨基酸殘基組成［8］。以磷酸化和非磷酸化兩種形式存在于感染鼠細(xì)小病毒的細(xì)胞質(zhì)中，在感染早期能夠被檢測到，但半壽期較短(90 min)。NS2參與病毒DNA復(fù)制，RNA翻譯，病毒衣殼的形成和病毒粒子單鏈DNA的包裝。也有人認(rèn)為NS2對衣殼蛋白的組裝和以宿主特異的方式翻譯方面均起到重要作用，但對犬細(xì)小病毒的基因組的復(fù)制影響不明確。細(xì)小病毒NS2通過位于3'端非翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)病毒mRNA的翻譯，而且能夠與核輸出受體相互作用影響病毒粒子的釋放［9］。

1.2.2 結(jié)構(gòu)蛋白(VP1，VP2，VP3) 基因組5'端的開放讀碼框編碼病毒的3種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1和VP2是可變剪切基因組右端讀碼框形成，VP2完全包含于VP1中。VP3是由VP2在組裝成了衣殼后經(jīng)蛋白酶切掉氨基端的9～15個(gè)氨基酸殘基而形成，存在于感染的病毒粒子中。

VP1由2 286～2 317位核苷酸，2 389～4 541位核苷酸編碼，基因全長2 181 nt，由726個(gè)氨基酸殘基組成。是病毒外殼的組成成分，大約有6～10個(gè)拷貝。VP1衣殼蛋白唯一的N端區(qū)是病毒感染所必需，但不是衣殼組裝所必需，VP1的N末端包含一組堿性氨基酸，這些氨基酸與核定位序列相似，4個(gè)堿性氨基酸組成的保守序列在肽鏈中能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其它蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，用單抗和多抗血清檢測，VP1單一區(qū)不裸露在衣殼表面，加熱和尿素處理后則使其暴露［10］。

VP2由2 787～4 541位核苷酸編碼，基因全長1 755 nt，編碼的584氨基酸殘基組成的蛋白是構(gòu)成衣殼的主要蛋白，大約有60個(gè)拷貝。CPV衣殼由8股單鏈以反平行的折疊組成，在幾股折疊之間有4個(gè)大的環(huán)，環(huán)1，3，4來自VP2分子，這些亞單位高度纏繞形成一個(gè)2.2 nm的纖突，這4個(gè)環(huán)組成大部分衣殼結(jié)構(gòu)的表面，而且環(huán)1，3，4是VP2組裝成病毒樣粒子所必需的，缺失環(huán)2不影響其組裝衣殼［8］。VP1和VP3對衣殼蛋白的組裝是非必需的，單獨(dú)VP2就能完成衣殼的組裝，在桿狀病毒中單獨(dú)表達(dá)VP2以及VP2和GFP融合蛋白均能夠形成病毒樣粒子，但體積較?。?1］。

VP2是構(gòu)成衣殼的主要蛋白，因而其表面結(jié)構(gòu)和氨基酸序列能決定病毒的許多特性。從抗原位點(diǎn)上看，兩個(gè)主要的抗原中和位點(diǎn)定位于4個(gè)環(huán)，位點(diǎn)A由一個(gè)VP2的環(huán)1和環(huán)2以及三重折疊軸的環(huán)4組成，環(huán)2上222位和224位氨基酸殘基的突變會影響這個(gè)表位抗原的構(gòu)象;環(huán)4上426位氨基酸殘基的變化產(chǎn)生了CPV-2a向CPV-2b的抗原漂移;位點(diǎn)B由大部分存在于環(huán)3的299，300和302位氨基酸殘基組成，而300位的氨基酸殘基是VP2上變化最大的氨基酸［12］。

從宿主范圍上看，VP2 93(Lys-Ans)，103(Ala-Val)，323(Asp-Asn)決定了CPV可以在犬細(xì)胞系和活體狗組織內(nèi)復(fù)制，而289，299，300，301位氨基酸殘基的變化與CPV能否在犬細(xì)胞系復(fù)制相關(guān)［12］。VP2中80(Lys-Arg)，564(Asn-Ser)，568(Arg-Gly)也很重要，這些殘基是衣殼中3個(gè)單體結(jié)合到一起的區(qū)域。另外，衣殼蛋白359～375位氨基酸殘基組成的柔性環(huán)結(jié)合Ca2+，是病毒感染所必需的，并影響病毒的宿主范圍。CPV結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn)，三重對稱的纖突控制了細(xì)胞的嗜性和宿主范圍［13，14］。

2 犬細(xì)小病毒的進(jìn)化

關(guān)于CPV的起源目前不是很確切，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CPV是以FPV的一個(gè)宿主變種出現(xiàn)于1978年。1974年以前沒有任何關(guān)于CPV-2的報(bào)道，1974年希臘首先發(fā)現(xiàn)CPV-2的陽性血清，1976年歐洲的血清中發(fā)現(xiàn)CPV-2的抗體。直到1978年，在美國和澳大利亞相繼發(fā)現(xiàn)CPV-2以后，世界上許多其它地區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)了CPV-2型抗體呈陽性，而且在世界各地的犬群中流行。1978年，CPV-2突然出現(xiàn)，并已出現(xiàn)了與最初CPV-2不同的基因型和抗原型變種(CPV-2a，CPV-2b)，新變種具有與CPV-2不同的宿主范圍，即新變種可以感染貓并進(jìn)行復(fù)制，而且在其他各國都有流行。隨著病毒的不斷進(jìn)化，CPV-2逐漸被CPV-2a和CPV-2b所取代，1996在越南等地又從豹貓中分離到新的血清型CPV-2c［15］。

迄今為止，CPV-2型被公認(rèn)只有1個(gè)血清型，但毒株間的抗原性有差異，這種差異稱之為抗原漂移。發(fā)生抗原漂移的原因是由于疫苗的作用，在免疫的壓力下發(fā)生變異，但變異株與原始株之間存在交叉反應(yīng)。變異株比原始株能更好地在犬體內(nèi)復(fù)制，因此傳播的機(jī)會多。RNA病毒的進(jìn)化速度快，部分是由于依賴于RNA的RNA聚合酶的易錯(cuò)性。但像CPV這樣的DNA病毒出現(xiàn)如此快的抗原替代和序列變化，并且將舊型完全取代是很少見的。犬細(xì)小病毒通過抗原漂移產(chǎn)生新的突變株有5個(gè)亞型:CPV-2，CPV-2a，CPV-2b，CPV2-c(a)和CPV2-c(b)。細(xì)小病毒的中和抗原位點(diǎn)位于VP2上，VP2上幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的改變就會改變抗原特征和宿主范圍。通過病毒發(fā)生的自然宿主漂移是很少發(fā)生的，但當(dāng)其發(fā)生時(shí)結(jié)果是很嚴(yán)重的，因?yàn)檫@種病毒可以通過先天免疫和非適應(yīng)的宿主群廣泛傳播。

大約在1979～1981年間，CPV-2在抗原性和基因型上逐漸被CPV-2a所取代。1979年CPV-2引發(fā)的病例逐漸增多，到1981年美國臨床病犬中主要分離到CPV-2a，日本、澳大利亞也出現(xiàn)相同的情況。1981年以后，CPV-2很少見報(bào)道。1984年美國監(jiān)測到另一種CPV-2變種CPV-2b，到1988年，美國主要是CPV-2b流行，但其他國家則是CPV-2a和CPV-2b混合流行，出現(xiàn)頻率相同。而意大利2001～2004收集的CPV-2型病毒中CPV-2a占73.13%，CPV-2b約8.95%，17.91%是VP2 Glu-426的突變種;在意大利CPV-2a比CPV-2b普遍的多，而且CPV-426Glu突變種從2000年開始出現(xiàn)，以后逐年增加，2004年檢測到60%的分離病毒是CPV-426Glu突變種［16～18］。歐洲、美國、日本等國家對CPV的研究都表明現(xiàn)在兩個(gè)新型CPV-2a和CPV-2b，已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)取代了CPV-2型。在我國，1982年梁士哲報(bào)道了疑似CPV-2的病例，次年徐漢坤等［19］正式報(bào)到了本病的流行，1984年在貓?jiān)I細(xì)胞上分離到該病毒。我國的CPV分離株也存在基因變異現(xiàn)象，除發(fā)現(xiàn)CPV-2，CPV-2a，CPV-2b突變株外，還發(fā)現(xiàn)在CPV-2a基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)化產(chǎn)生的2個(gè)新的變異株。

病毒衣殼蛋白VP2決定了病毒的宿主范圍和其他生物學(xué)特性，而且只有很少的氨基酸替換就可明顯改變病毒的遺傳和抗原特性CPV-2a，CPV-2b和CPV-2僅存在6個(gè)氨基酸殘基的差異，而CPV-2a和CPV-2b僅有2個(gè)氨基酸的差異，555位氨基酸Ile曾經(jīng)是CPV-2a的特異性位點(diǎn)，CPV-2b發(fā)生了恢復(fù)突變，為Val，但1990年以后出現(xiàn)的CPV-2a也突變?yōu)閂al(555)(表1)。根據(jù)其變化歸結(jié)為CPV-2a，555位氨基酸殘基為Val。CPV-2a的氨基酸殘基555有兩種Ile和Val。目前分離的CPV-2a亞型一般為555Val，國內(nèi)公布的CPV-2a的VP2基因測序結(jié)果顯示第555位都是Val。

表1 肉食動(dòng)物細(xì)小病毒VP2蛋白氨基酸殘基的變異

CPV的抗原型在不同的國家各不相同(表2)。在美國和南美，CPV-2b是CPV的主要亞型;在英國、德國和西班牙，CPV-2a和CPV-2b亞型發(fā)生的概率一樣;在意大利和我國臺灣地區(qū)，仍以CPV-2a亞型為主［20，21］。CPV在我國的流行與在意大利、澳大利亞和英國的流行情況相似，CPV-2a比其他毒株更為流行［22，23］。20世紀(jì)80年代早期CPV-2曾在我國流行，但1986年后分離到的CPV以CPV-2a為主。謝景之等報(bào)道，在2002年送檢的8份病料中分離到4株CPV-2a和4株CPV-2b。PV(貉)CC-1-86在CPV-2a的基礎(chǔ)上VP2 300位氨基酸殘基發(fā)生G→S替換，PV(犬)JL-102在CPV-2a的基礎(chǔ)上VP2發(fā)生氨基酸564S→N替換，其確切的生物學(xué)意義尚不清楚。我國的CPV分離株與參考毒株的核酸同源性超過98%，沒有形成明顯的中國CPV分支，進(jìn)化方式與文獻(xiàn)報(bào)道的進(jìn)化方式一致。

近年來，CPV-2a和CPV-2b廣泛并存，但CPV-2a占優(yōu)勢地位。也有報(bào)道表明，目前國內(nèi)市場上所使用的荷蘭Intervet的CPV疫苗株的抗原型與分離于南京地區(qū)臨床發(fā)病犬的5株CPV分離株同為CPV-2b亞型。所以，從1982年至今在南京地區(qū)CPV流行的主要是CPV2-2b亞型［24］。邱薇等［25］對9株病毒VP2的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和序列測定，將其核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與CPV參考株進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)此次分離到的9株CPV 6個(gè)是CPV-2a和3個(gè)是CPV2-2b。

表2 不同國家不同時(shí)間FPLV，CPV-2，CPV-2a，CPV-2b的分離情況

3 總結(jié)與展望

犬細(xì)小病毒從出現(xiàn)到目前僅有近30年的歷史。由于該病毒引起的犬細(xì)小病毒病，發(fā)病率高，死亡率也高，特別是幼犬死亡率更高，是目前危害養(yǎng)犬業(yè)的主要傳染病。而且由于該病毒經(jīng)歷了較快的進(jìn)化速度，血清型也不斷出現(xiàn)新的變異，所以該病毒目前仍然沒有得到有效的控制。了解該病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)和進(jìn)化，對該犬細(xì)小病毒病的預(yù)防和控制具有重要意義。

國外對于CPV做了許多研究工作，關(guān)于其流行特點(diǎn)和進(jìn)化、宿主范圍、基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等方面均有報(bào)道。但關(guān)于中國毒株的報(bào)道卻很少，國內(nèi)關(guān)于細(xì)小病毒的研究多數(shù)集中在血清分型和VP2結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列研究，更為詳盡的研究幾乎沒有。未來的研究工作應(yīng)該主要集中于以下方面:

(1)了解中國發(fā)病的犬細(xì)小病毒的基因組特點(diǎn)，進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，進(jìn)而研究中國細(xì)小病毒的進(jìn)化。

(2)深入研究病毒結(jié)構(gòu)蛋白的功能以及與宿主蛋白的互作機(jī)理，為犬細(xì)小病毒的預(yù)防和控制奠定理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)