夏世金 吳俊珍 孫濤 胡明冬 錢桂生

·論 著·

Gax基因?qū)Φ脱跣苑蝿用}內(nèi)皮細胞增殖、凋亡和周期的影響

夏世金 吳俊珍 孫濤 胡明冬 錢桂生

目的觀察Gax基因?qū)Φ脱跣苑蝿用}內(nèi)皮細胞（PAECs）增殖、凋亡和周期的影響。方法PAECs分為4組：未轉(zhuǎn)染常氧對照組（常氧組）、未轉(zhuǎn)染低氧處理組（低氧組）、Ad?βGal轉(zhuǎn)染后低氧處理組（Ad?βGal＋低氧組）、Ad?Gax轉(zhuǎn)染后低氧處理組（Ad?Gax＋低氧組）。在常氧和低氧處理1、3、6 h和12 h后，3H?TdR摻入法測PAECs增殖、流式細胞術(shù)測細胞周期和凋亡率。結(jié)果與常氧組比較，低氧組和Ad?βGal＋低氧組PAECs3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），低氧6 h最大；Ad?Gax＋低氧組與常氧組比較均顯著升高（P均＜0.01），與低氧組比較均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h降幅最大。與常氧組比較，Ad?βGal＋低氧組和低氧組PAECs凋亡率均顯著降低（P均＜0.05），低氧6 h最低。Ad?Gax＋低氧組與常氧組比較均顯著上升（P＜0.01或P＜0.05），與低氧組比較均明顯增加（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h增幅最大。與常氧組比較，低氧組和Ad?βGal＋低氧組G0/G1期比例明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h最低；S期和G2/M期比例顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h S期比例最大。與常氧組和低氧組比較，Ad?Gax＋低氧組G0/G1期比例均顯著上升（P＜0.05或P＜0.01），低氧6 h增幅最大；S期和G2/M期比例顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧6 h降幅最高。結(jié)論

Gax基因；低氧；肺動脈高壓；內(nèi)皮細胞；增殖；凋亡；細胞周期

低氧性肺動脈高壓（HPH）對人的長期嚴(yán)重危害依然存在。HPH是一治療極為棘手、高致死率和致殘率的病理生理綜合征［1］，在老年人中多發(fā)。肺內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞是組成肺血管壁最重要的細胞，低氧時這兩種細胞結(jié)構(gòu)與功能異常是HPH形成的主要病理生理機制。前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧下調(diào)大鼠肺動脈內(nèi)源性生長終止特異性同源盒基因Gax轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，而大鼠經(jīng)氣道轉(zhuǎn)染攜帶Gax基因的重組腺病毒載體（Ad?Gax），發(fā)現(xiàn)Gax基因在大鼠肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）和肺動脈內(nèi)皮細胞（PAECs）中均過表達，并能預(yù)防低氧誘導(dǎo)大鼠HPH的發(fā)生［2］；Ad?Gax轉(zhuǎn)染抑制低氧性PASMC異常增殖［2］、誘導(dǎo)細胞凋亡［3］、使細胞 G0/G1比例顯著升高、S＋G2/M比例顯著降低［4］。但是，Gax基因?qū)AECs增殖、凋亡和周期有何影響目前尚不清楚。因此，本實驗通過Ad?Gax轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠PAECs，觀察Gax基因過表達對低氧性PAECs增殖、凋亡和細胞周期的影響，為進一步研究Gax基因調(diào)節(jié)HPH的作用與機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 健康成年雄性Sprague?Dawley大鼠，購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心；攜帶大鼠Gax基因的重組腺病毒Ad?Gax載體和攜帶大鼠LacZ基因的重組腺病毒Ad?βGal載體（由美國波士頓大學(xué)Kenneth Walsh博士惠贈）；高糖細胞培養(yǎng)基（DMEM，Gibco，USA）、0.25％胰蛋白酶（Gibco，USA）、胎牛血清（FBS，Gibco，USA）、細胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶（Coming，USA）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma）；自動常壓缺氧孵箱（德國賀氏公司）；氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷（3H?TdR，上海原子能研究所）；β液閃計數(shù)儀（Beckmen）。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 PAEC的培養(yǎng)、鑒定與低氧處理 取150～200 g成年健康SD大鼠共40只，隨機分為4組，每組10只。10％烏拉坦腹腔注射麻醉，無菌取大鼠肺動脈，放入含有100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素PBS平皿，將血管外脂肪組織分離沖洗干凈，用細絲線扎住一端血管，用鑷子輕輕夾住結(jié)扎的血管末端，再用一根鐵絲將扎住的末端捅進血管，將血管翻過來，使內(nèi)皮細胞面朝外，扎住另一端。將血管放入盛有0.1％膠原酶的離心管內(nèi)，37℃消化15 min，震蕩使細胞脫落，離心，洗滌后用DMEM培養(yǎng)液加入10％FBS于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，細胞生長融合后，用0.25％胰蛋白酶消化傳代。將細胞貼于蓋玻片上，以1％的多聚甲醛固定5 min，免疫細胞化學(xué)染色檢查抗Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體陽性染色和形態(tài)學(xué)鑒定細胞。3～5代細胞用于本實驗。將細胞放置于自動常壓缺氧孵箱中低氧處理。待細胞長至瓶底的70％～80％，換含0.4％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基使PASMCs同步生長48 h。在常氧（21％O2）和低氧（2.5％O2）處理后在各觀察時間點檢測指標(biāo)。

1.3 實驗分組與基因轉(zhuǎn)染 PAECs分為4組：未轉(zhuǎn)染常氧對照組（常氧組）、未轉(zhuǎn)染低氧處理組（低氧組）、Ad?βGal轉(zhuǎn)染再行低氧處理組（Ad?βGal＋低氧組）、Ad?Gax轉(zhuǎn)染再行低氧處理組（Ad?Gax＋低氧組）。分別在常氧和低氧處理1 h、3 h、6 h和12 h各時間點檢測相應(yīng)指標(biāo)。Ad?Gax和Ad?βGal經(jīng)擴增、鑒定、純化后用于實驗［2］。待細胞長至80％或接近完全融合成片時，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，然后吸出培養(yǎng)液，加入感染復(fù)數(shù)為80的Ad?Gax轉(zhuǎn)染液，在37℃、5％CO2細胞孵箱培養(yǎng)1 h后棄轉(zhuǎn)染液。未轉(zhuǎn)染組不加Ad?Gax或Ad?βGal轉(zhuǎn)染液，其余同轉(zhuǎn)染組。

1.43H?胸腺嘧啶核苷（3H?TdR）摻入法檢測細胞增殖 調(diào)整細胞濃度為1×105/ml。分別取各組細胞1 ml接種于96孔培養(yǎng)板，每組每個實驗條件設(shè)3個重復(fù)孔。37℃、5％CO2培養(yǎng)24 h后，每孔加入37 kBq3H?TdR，再培養(yǎng)6 h后棄培養(yǎng)基，PBS液終止摻入，加入0.25％胰酶消化細胞，收集細胞于玻璃纖維紙上，生理鹽水沖洗3次，用10％三氯乙酸（TCA）固定，無水乙醇脫色，80℃干烤30 min，濾膜烘干后置于閃爍瓶中加入閃爍液，用液體閃爍計數(shù)儀測定每分鐘脈沖數(shù)（count perminute，CPM）值。實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡率 取對數(shù)生長期的單層細胞，0.25％胰酶消化，待細胞變圓有脫落趨勢時，立即豎起培養(yǎng)瓶，棄去胰酶。加入3～4 ml無鈣、鎂離子的PBS，用吸管反復(fù)吹打使成單細胞懸液。單細胞懸液用70％的冷乙醇固定后，調(diào)整細胞濃度為109個/ml；取1 ml細胞懸液，用PBS離心洗2次；棄上清后余下約0.5 ml，加入RNA酶A（每樣品約3000活性單位），37℃孵育30 min；冰浴停止RNA酶作用；加入1.5 ml PI染料（50μg/ml，4℃避光孵育30 min；在流式細胞儀上進行檢測。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PAEC的生長與鑒定 細胞培養(yǎng)2 h后可見細胞貼壁。過夜后貼壁細胞明顯增多。早期呈多角形或梭形，形成致密的單層細胞時，呈“鋪路石”狀排列。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細胞化學(xué)染色，可見胞漿呈陽性，胞核呈陰性，證明所培養(yǎng)的細胞為PAECs。

2.2 Ad?Gax基因轉(zhuǎn)染對PAECs中CPM值的影響 與常氧組同時點相比較，低氧組PAECs的3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），在低氧1～6 h，低氧組PAECs的3H?TdR摻入量漸增，6 h最大，低氧12、24 h緩慢下降；與常氧組同時相比較，Ad?βGal＋低氧組PAECs的3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），但與低氧組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）；與常氧組同時點相比較，Ad?Gax＋低氧組PAECs的3H?TdR摻入量均顯著升高（P均＜0.01），但與低氧組比較，3H?TdR摻入量均明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），低氧1～6 h降幅漸增，6 h時降幅最大，低氧12、24 h降幅減小。見表1。

2.3 Ad?Gax基因轉(zhuǎn)染對PAECs凋亡率的影響 與常氧組同時點相比較，低氧組和 Ad?βGal＋低氧組PAECs凋亡率均明顯降低（P均＜0.05），低氧1、3 h，低氧組PAECs的凋亡率漸降，低氧6 h最低，低氧12、24 h緩慢上升；與常氧組同時點相比較，Ad?Gax＋低氧組 PAECs凋亡率均顯著上升（P＜0.01或P＜0.05），與低氧組比較，凋亡率也均明顯增加（P＜0.01或P＜0.05），低氧1～6 h增幅漸大，6 h時增幅最大，低氧12、24 h增幅漸減。見表2。

表1 在各種條件下PAECs3H?TdR摻入量CPM值比較（±s，n＝3）

表1 在各種條件下PAECs3H?TdR摻入量CPM值比較（±s，n＝3）

注：與常氧組比較，??P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

時點 常氧組 低氧組 Ad?βGal＋低氧組Ad?Gax＋低氧組0 h 5935.77±831.54 5954.63±833.56 5944.23±832.18 5950.22±833.07 1 h 5897.98±826.15 9846.69±1378.54?? 9839.72±1377.58?? 8125.37±1137.55??△△3 h 5967.12±835.41 13 068.92±1829.67?? 13 110.11±1835.42?? 11 366.45±1591.31??△△6 h 5929.43±830.26 14 183.65±1985.73?? 14 179.95±1985.19?? 11 973.34±1676.28??△△12 h 5885.83±824.16 12 673.62±1774.31?? 12 701.29±1778.18?? 12 983.86±1817.75??△24 h 5942.74±831.98 8125.47±1137.57?? 8136.24±1139.08?? 8530.29±1194.32??△

表2 在各種條件下PAECs凋亡率比較（±s，％，n＝3）

表2 在各種條件下PAECs凋亡率比較（±s，％，n＝3）

注：與常氧組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與低氧組比較，△△P＜0.01

組別 0 h 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h常氧組 3.95±0.55 3.98±0.57 3.88±0.54 3.91±0.55 3.89±0.54 3.87±0.54低氧組 3.99±0.56 2.05±0.29? 2.03±0.28? 1.95±0.27? 3.07±0.43? 2.39±0.33?Ad?βGal＋低氧組 3.89±0.54 2.10±0.29? 2.07±0.29? 2.13±0.30? 3.12±0.44? 2.28±0.32?Ad?Gax＋低氧組 3.97±0.56 10.35±1.45??△△11.34±1.59??△△14.45±2.03??△△7.55±1.06?△△ 6.17±0.86?△△

2.4 Ad?Gax基因轉(zhuǎn)染對PAECs周期的影響 與常氧組同時相比較，低氧組PAECs的G0/G1期比例明顯降低（P＜0.05、P＜0.01），低氧1～6 h，低氧組PAECs的G0/G1期比例漸降，6 h最低，低氧12、24 h緩慢上升；而S期和G2/M期比例顯著增加（P＜0.05、P＜0.01），S期比例低氧6 h最大。與常氧組同時點相比較，Ad?βGal＋低氧組內(nèi)皮細胞G0/G1期、S期和G2/M期比例出現(xiàn)與低氧組類似的變化，Ad?βGal＋低氧組與低氧組各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）；與常氧組同時相比較，Ad?Gax＋低氧組PAECs的G0/G1期比例均顯著上升（P＜0.05、P＜0.01），與低氧組比較，G0/G1期比例也均明顯增加（P＜0.01、P＜0.05），低氧1～6 h增幅漸大，6 h時增幅最大，低氧12 h、24 h增幅減小；與常氧組和低氧組同時相比較，Ad?Gax＋低氧組PAECs的S期和G2/M期比例顯著降低（P＜0.01、P＜0.05），6 h時降到最低值。見表3。

表3 肺內(nèi)皮細胞在各種條件下細胞周期變化結(jié)果比較（± s，％，n＝3）

表3 肺內(nèi)皮細胞在各種條件下細胞周期變化結(jié)果比較（± s，％，n＝3）

注：與常氧組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M常氧組0 h 72.49±10.14 22.32＋3.12 5.18＋0.73 1 h 73.38±10.27 21.94＋3.07 4.69＋0.65 3 h 72.98±10.21 22.01＋3.08 5.03＋0.71 6 h 72.01±10.08 22.85＋3.20 5.13＋0.72 12 h 73.04±10.22 21.92＋3.06 5.04＋0.71 24 h 72.58±10.16 22.22＋3.11 5.19＋0.73低氧組0 h 72.61±10.17 22.52＋3.15 5.11＋0.71 1 h 62.58±8.76?? 24.66＋3.45? 12.76±1.79??3 h 59.23±8.29?? 26.78±3.75?? 13.89±1.94??6 h 56.68±7.94?? 36.49±5.11?? 6.84±0.96?12 h 62.32±8.72?? 33.61±4.71?? 4.03±0.57?24 h 70.25±9.84? 25.12±3.52? 4.60±0.63?Ad?βGal＋低氧組0 h 72.71±10.15 21.99±3.08 5.29±0.74 1 h 61.97±8.68?? 24.75±3.47?? 13.28±1.86??3 h 59.78±8.36?? 27.67±3.87? 12.54±1.76??6 h 55.98±7.84?? 37.13±5.19?? 6.88±0.96??12 h 62.41±8.73?? 33.91±4.74?? 3.67±0.51?24 h 69.98±9.80? 25.36±3.55? 4.65±0.65?Ad?Gax＋低氧組0 h 72.40±10.13 22.16±3.12 5.20±0.73 1 h 76.34±10.69?△△12.94±1.78??△△10.67±1.48??△△3 h 80.45±11.26??△△11.57±1.62??△△7.97±1.12?△△6 h 86.17±12.34??△△10.27±1.44??△△3.55±0.49?△△12 h 75.04±10.39?△△12.02±1.68??△△12.93±1.81??△△24 h 73.93±10.35?△ 12.96±1.81??△△13.10±1.83??△△

3 討論

本研究采用比較準(zhǔn)確反映細胞增殖的先進方法（3H?TdR摻入法）和比較準(zhǔn)確反映細胞周期和凋亡率的先進手段（流式細胞術(shù)），觀察Ad?Gax基因轉(zhuǎn)染對體外原代培養(yǎng)的PAECs增殖、凋亡和細胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧早期內(nèi)皮細胞增殖加速，而此時增強Gax基因的表達可抑制細胞的異常增殖，抑制細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，并誘導(dǎo)細胞凋亡；隨著低氧時間的不斷延長，細胞增殖受到抑制，而此時增強內(nèi)皮細胞中Gax基因表達卻又激活細胞增殖，促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期比例，抑制凋亡，以此來維持細胞的數(shù)量。可見，Gax對維持內(nèi)皮細胞數(shù)量的動態(tài)平衡具有雙向調(diào)節(jié)作用。

Gax基因是在1993年由Gorski等［5］克隆出的一種同源異形盒（homeobox）基因，其編碼的蛋白是一種核轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活或抑制其下游基因的表達。Gax基因抑制內(nèi)皮細胞異常增殖。增強內(nèi)皮細胞Gax基因表達可通過p21高表達來抑制促血管生成因子所致的內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)變［6］。體外實驗結(jié)果顯示腺病毒介導(dǎo)Gax基因轉(zhuǎn)染抑制內(nèi)皮細胞遷移［7］。本研究結(jié)果也證實Gax基因過表達抑制內(nèi)皮細胞的異常增殖，與上述研究結(jié)果相符。然而，Gax基因也能促進內(nèi)皮細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，增強人腦內(nèi)皮細胞Gax基因表達能促進新的血管生成，即Gax基因過表達可促進人腦內(nèi)皮細胞的增殖，提高細胞數(shù)量，改善神經(jīng)血管功能失調(diào)［8］。本研結(jié)果證實在低氧處理后期，Gax過表達可促進內(nèi)皮細胞增殖，與上述結(jié)果一致。

從本研究結(jié)果可以得出Gax基因可能只對異常增殖的細胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，以及Gax對內(nèi)皮細胞生物學(xué)功能具有雙向調(diào)節(jié)作用的新觀點。本研究結(jié)果表明，當(dāng)?shù)脱醮碳な筆AECs數(shù)量異常增加時，Gax基因起到抑制細胞數(shù)量的作用，而當(dāng)?shù)脱醮碳r間越長，細胞數(shù)量逐漸減少時，此時Gax基因卻起到阻止細胞數(shù)量減少的作用。因此，我們認(rèn)為，內(nèi)皮細胞在低氧早期，低氧可能誘發(fā)細胞內(nèi)源性的自我保護機制，激活細胞內(nèi)促增殖信號通路，促進細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，促進細胞的增殖，抑制細胞凋亡；而當(dāng)?shù)脱醴e累到一定程度，促細胞增殖信號通路漸漸失活，抑制細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，細胞增殖受到抑制，而凋亡現(xiàn)象減弱。我們推測，當(dāng)細胞出現(xiàn)異常增殖時，Gax基因就啟動細胞內(nèi)抑制細胞數(shù)量的機制，而當(dāng)細胞數(shù)量出現(xiàn)異常減少時，Gax基因卻啟動細胞內(nèi)維持細胞數(shù)量的機制。而這些機制尚需深入研究。

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Effect of Gax gene transfer on proliferation，apoptosis and cell cycle of hypoxic pulmonary arterialendothelial cells

XIA Shi?jin.Shanghai Institute ofGeriatrics；WU Jun?zhen，SUN Tao.Department ofGeriatrics，Huadong Hospital，F(xiàn)u?dan University，Shanghai200040，China；HU Ming?dong，QIAN Gui?sheng.Department of Respiratory Diseases，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China

Objective To study the effect of Gax gene transfer on proliferation，apoptosis and cell cycle of hypoxic pulmonary arterial endothelial cells. M ethods Rat pulmonary arterial endothelial cells（PAECs）were divided into 4 groups：non?transfected normoxia goup（normoxia group），untransfected hypoxic treatment group（hypoxia group），Ad?βGal transfection and hypoxic treatment group（Ad?βGal＋hypoxia group），Ad?Gax transfection and hypoxic treatment group（Ad?Gax＋hypoxia group）.Under conditions of normoxia or hypoxia for 1 hour，3 hours，6 hours and 12 hours，cells proliferation was assessed by using3H?thymidine（3H?TdR）incorporation assay，while cell apoptosis and cell cycle were evaluated with flow cytometry. Results （1）Compared with the normoxia group，the3H?TdR incorporation of PAECs was significantly increased in the hypoxia group and Ad?βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.01）.And it reached themaximum at6?hour?hypoxia time point.The3H?TdR incorporation of PAECs in the Ad?Gax＋hypoxia group was higher than that in the normoxia group（P＜0.01）and lower than the hypoxia group（P＜0.01，P＜0.05）.The largest decline occurred at6?hour?hypoxia time point.（2）Compared with the normoxia group，the apoptosis rate of PAECs were significantly decreased in the hypoxia group and Ad?βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.05）.And it reached theminimum at6?hour?hypoxia time point.The apoptosis rate of PAECs in the Ad?Gax＋hypoxia group was higher than that in the normoxia group and the hypoxia group（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase occurred at6?hour? hypoxia time point.（3）Compared with the normoxia group，the PAECs in G0/G1phases were significantly decreased in the hy?poxia group and Ad?βGal＋hypoxia group in various time points（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest decline occurred at 6?hour?hypoxia time point.Whereas the PAECs in S and G2/Mphases were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase of S phase PAECs occurred at 6?hour?hypoxia time point.Compared with the normoxia group and hypoxia group at the same time points，the PAECs in G0/G1phases in the Ad?Gax＋hypoxia group significantly increased（P＜0.01，P＜0.05）.And the largest increase of G0/G1pha?ses PAECs occurred at6?hour?hypoxia time point.Whereas the PAECs in Sand G2/M phaseswere significantly decreased（P＜0.01，P＜0.05）.The largest increase of S and G2/M phases PAECs occurred at 6?hour?hypoxia time point. Con?clusions Gax plays a bidirectional regulatory role inmaintaining endothelial cells in number homeostasis via regulating cell proliferation，apoptosis and cycle.

Gax gene；hypoxia；pulmonary arterial hypertension；endothelial cell；proliferation；apoptosis；cell cycle

R 544.16

A

10.3969/j.issn.1003?9198.2013.12.005

2013?07?15）

國家自然科學(xué)基金（81270115）

200040 上海市，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院上海市老年醫(yī)學(xué)研究所（夏世金），老年醫(yī)學(xué)科（吳俊珍，孫濤）；400037 重慶市，第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院呼吸科（胡明冬，錢桂生）

Gax基因干預(yù)低氧性PAECs增殖、凋亡和周期，雙向調(diào)節(jié)并維持細胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)。