吳云虎，王殿華

ADMA/DDAH 通路在腦缺血-再灌注機(jī)制中研究較多，但在腦缺血-再灌注致肺損傷中對(duì)PMVECs通透性的作用機(jī)制仍未見(jiàn)有報(bào)道。本研究探討ADMA/DDAH 通路調(diào)控PKCα 和MCK 蛋白表達(dá)對(duì)PMVEC 的影響，進(jìn)一步揭示ADMA/DDAH 通路在腦I/R 致ALI 中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌雄各半SD 大鼠36只，每體重200～260g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑:ADMA 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司;MTT 試劑購(gòu)自Biomol 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司;2×Taq PCR MasterMix 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;RIPA 裂解液、PKC 和MLCK 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司;RT-PCR試劑盒，批號(hào):9440-94A。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血再灌注模型的建立 參照Z(yǔ)ea-Longa 改良線(xiàn)栓法制作大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO);參照Z(yǔ)ea-Longa 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MCAO 進(jìn)行評(píng)分。

1.2.2 腦缺血再灌注損傷大鼠血清的采集各組大鼠按設(shè)定處死時(shí)間，以氯胺酮麻醉后頸動(dòng)脈置管，取1.0ml 血置于檸檬酸抗凝管搖勻，3000 轉(zhuǎn)/min 離心，留取上清。分為滅活血清組和非滅活血清組處理:選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)，對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入與血清等體積的水，調(diào)節(jié)水浴箱溫度控制鈕，使溫度保持在56℃，定時(shí)30min 進(jìn)行血清滅活，滅活后－20℃～－70℃保存。

1.2.3 大鼠PMVECs 的培養(yǎng) 取體健康雄性Wistar 大鼠1 只，麻醉固定后，取出肺臟至DMEM 培養(yǎng)液中，切割至約1mm3大小的組織塊，均勻放置在25ml 培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)60h 后去除組織塊，于80%～90%細(xì)胞單層匯合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化后1∶2 傳代。

1.2.4 細(xì)胞傳代 當(dāng)EC 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右傳代，用D-Hank’s:液漂洗3 次，加0.25%胰養(yǎng)蛋白酶1ml 于瓶中，使細(xì)胞充分接觸消化液，用吸管吹打細(xì)胞懸液，將此瓶細(xì)胞懸液分成二份加入新瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。以下實(shí)驗(yàn)采用2～5 代細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠PMVECs 放在100ml 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待80%單層匯合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為5 組:正常細(xì)胞組、正常滅活血清組、正常非滅活血清組、模型滅活血清組、模型非滅活血清組、ADMA 干預(yù)組和DDAH 抑制劑干預(yù)組。以上各組在培養(yǎng)箱中孵育4h，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.6 RT-PCR 法檢測(cè)PKC 和MLCK mRNA的表達(dá) 按Trizol 法提取總mRAN，按照一步法RTPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，獲得目的基因DNA 片段。引物序列:上游引物 5’-TGTCCAAAACCTACCCCACCATAT-3’，下游引物5’-CCCTTCTTACATCAGCCCTACTG-3’，擴(kuò)增片段為73bp 大小(引物合成由日本TaKaRa 公司合成)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，Gel-Doc 紫外凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算各條帶的灰度值。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞PKC 和MLCK 的表達(dá) 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度近80%時(shí)，oxLDL 刺激6h 后加不同試劑，培養(yǎng)40min 檢測(cè)信號(hào)蛋白表達(dá)，12h 后檢測(cè)PKCα 和MLCK 表達(dá)，用PBS(pH7.4)洗3 遍，加入0.5ml RIPA buffer，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來(lái)，放到1.5ml 的EP 管中，冰上放置30min;在超速冷凍離心機(jī)中14000rpm 離心20min，保留上清;用Lorry 法對(duì)不同的細(xì)胞裂解產(chǎn)物定量其總蛋白濃度;按1∶1的比例加入2×蛋白上樣緩沖液，沸水煮5min;SDSPAGE 電泳125g/L 使用聚丙烯酰胺凝膠。封閉液在室溫下封閉1h，加入抗myc 抗體4℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 抗體形成免疫復(fù)合物，DAB 顯色后攝像。

1.2.8 MTT 法細(xì)胞增殖/抑制活性測(cè)定 取經(jīng)不同濃度處理24h 的細(xì)胞孔，加入體積分?jǐn)?shù)為0.05g/L MTT 10μl/孔繼續(xù)培養(yǎng)4h，取板，吸盡上清，各孔加DMSO 100μl，室溫避光震蕩10min，讀取A492 值(OD)/孔。依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，對(duì)各干預(yù)組測(cè)定3 個(gè)平行孔A490 值(OD)，細(xì)胞增殖率(%)=［實(shí)驗(yàn)組490A 值(OD)/正常對(duì)照組490A 值(OD)］×100%，其結(jié)果均以增殖指數(shù)＞100% 表示細(xì)胞刺激增殖作用。同樣方法測(cè)定A570 值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與其余3 組比較，模型滅活血清組、模型非滅活血清組和ADMA 組PMVEC 中PKCα 和MLCK 蛋白水平明顯升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余3 組之間PKCα 和MLCK 蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表1、圖1)。

2.2 PMVEC 中PKCα、MLCK mRNA 的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與其余3 組比較，模型滅活血清組、模型非滅活血清組和ADMA 組PMVEC 中PKCα、MLCK mRNA 表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余3 組之間PKCα 和MLCK 蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)表2、圖2)。

2.3 PMVEC 細(xì)胞增殖活性 與其余4 組OD值(λ=490 波長(zhǎng))比較，模型滅活血清組和ADMA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，細(xì)胞代謝活力顯著降低;與ADMA 組相比較，DDAH 組OD 值顯著增高，細(xì)胞代謝活力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表3)。

表1 PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白表達(dá)灰度值(±s)

表1 PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白表達(dá)灰度值(±s)

與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P＜0.05

表2 PMVEC 中PKC、MLCK mRNA 表達(dá)灰度值(±s)

表2 PMVEC 中PKC、MLCK mRNA 表達(dá)灰度值(±s)

與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P＜0.05

表3 各組的細(xì)胞增殖(±s)

表3 各組的細(xì)胞增殖(±s)

與其余4 組比較* P＜0.01

圖1 腦I/R 損傷致ALI 細(xì)胞模型中PMVEC 中PKCα、MLCK 蛋白表達(dá)。與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P＜0.05

圖2 腦I/R 損傷致ALI 細(xì)胞模型中PMVEC 中PKCα、MLCK mRNA 表達(dá)。與正常滅活血清組、正常非滅活血清組和DDAH 干預(yù)組比較* P＜0.05

3 討論

新近研究證實(shí)［1，2］ADMA/DDAH 通路在體內(nèi)多個(gè)器官的細(xì)胞中存在，該通路參與多種生理和病理過(guò)程，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

ADMA 在蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methytransferases，PRMT)作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylme-thionine，SAM)為甲基供體，使各種多肽中的L-精氨酸殘基甲基化，甲基化的蛋白質(zhì)水解以后產(chǎn)生。ADMA 的主要降解及排泄系統(tǒng)是在二甲基精氨酸二甲氨水解酶(dimethylargininedimethy laminohydrolase，DDAH)作用下分解為瓜氨酸和二甲胺經(jīng)腎臟排出，所以PRMT 及DDAH 控制著ADMA 在體內(nèi)的濃度，ADMA 的代謝途徑即ADMA/DDAH 通路［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)，有多種細(xì)胞能生成ADMA，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞，健康人血漿中ADMA 的濃度為(1.15±0.13)μmol/L，內(nèi)皮細(xì)胞中的精確濃度尚未得知，但細(xì)胞內(nèi)ADMA 的濃度大約是培養(yǎng)液中的8～12 倍［5，6］。

ADMA 是內(nèi)源性NOS 抑制劑。大量的研究證實(shí)ADMA 能競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS，阻止NO 合成，增加氧自由基的生成和引發(fā)血管炎癥。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)ADMA 聚集是內(nèi)皮功能不全的一個(gè)重要原因，其增高預(yù)示心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)和死亡率增高［7］。DDAH 的表達(dá)增強(qiáng)可以起到抑制ADMA 生成的作用，使用維甲酸上調(diào)DDAH 表達(dá)可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞ADMA 表達(dá)減少，含量下降，NO 合成增加。因此，DDAH 是一種比較理想的血管保護(hù)因子，ADMA/DDAH 通路可能在氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)皮保護(hù)作用之間產(chǎn)生有意義的影響，合理調(diào)整DDAH 含量，增強(qiáng)其表達(dá)，抑制ADMA 含量的增加，降低其表達(dá)，可以對(duì)缺血再灌注損傷起到很好的保護(hù)作用［8，9］。

PKC 的持續(xù)高表達(dá)和異常激活是導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的最主要原因。PKC 激活后對(duì)肌動(dòng)蛋白肌絲相關(guān)蛋白進(jìn)行磷酸化，并能夠使肌球蛋白ATP 酶活性增加，從而使肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互結(jié)合維持持續(xù)的肌絲的收縮［10］;PKCα 亦可參與促進(jìn)絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)的激活過(guò)程，而MAPK 的激活在維持平滑肌的持續(xù)收縮和膠原纖維增生中起重要作用［11］;另外，PKCα 還可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸激酶(PTK)Rho 蛋白的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)肌絲的收縮［12］;MLCK 介導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，導(dǎo)致通透性增加，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙的形成和屏障功能障礙［13］。

經(jīng)ADMA 干預(yù)后，MLCK 的蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，提示ADMA 可以增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，導(dǎo)致MLCK 活性不斷升高，MLCK 催化MLC 磷酸化程度加大，導(dǎo)致EC 的向心性收縮增強(qiáng)，細(xì)胞間隙形成程度加大，從而在一定程度上加重了氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)展。經(jīng)過(guò)DDAH 干預(yù)后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透程度有所下降，細(xì)胞的通透性得到修復(fù)，內(nèi)膜增厚，此修復(fù)的結(jié)果使得MLCK 的蛋白表達(dá)和蛋白含量明顯下降，并能降低MLCK 的轉(zhuǎn)錄，阻止缺血再灌注肺損傷的進(jìn)一步發(fā)展，在一定程度上起到了肺保護(hù)的作用。

本部分研究主要發(fā)現(xiàn):體外培養(yǎng)的PMVEC 在給予腦缺血-再灌注大鼠滅活的血清和外源性ADMA干預(yù)后，由于PMVEC 培養(yǎng)液中ADMA 含量增高，PKCα、MLCK 蛋白和mRNA 表達(dá)增加，細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)明顯下降。這些發(fā)現(xiàn)提示ADMA/DDAH 通路在腦缺血-再灌注損傷所致ALI 可能起著重要作用，可以作為防治缺血再灌注藥物新的潛在的干預(yù)靶點(diǎn)，研究藥物干預(yù)ADMA 的生成代謝，干預(yù)ADMA/DDAH 系統(tǒng)，上調(diào)DDAH 的表達(dá)，抑制ADMA 的生成，因此推測(cè)藥物干預(yù)ADMA 的代謝或?qū)⑹欠乐稳毖俟嘧⒓膊?dǎo)致ALI 的一個(gè)新的治療目標(biāo)。

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