羅連響，李曉玲，鮑 波，3

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，可能是由線粒體功能障礙、氧化應激、細胞凋亡和泛素-蛋白酶體功能失調(diào)等多種機制引起的［1］。番茄紅素是一種天然色素，廣泛存在于番茄、胡蘿卜、西瓜、番石榴等蔬菜和水果中，其化學結(jié)構(gòu)式中含有11 個共軛雙鍵及2 個非共軛雙鍵，這種多不飽和脂肪烴結(jié)構(gòu)使得該化合物具有超強的抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素具有抗腫瘤［2］、抗炎癥和抗心血管［3］疾病等多方面的生物學活性。另外，番茄紅素可以被人體吸收，通過“血腦屏障”進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)元的保護作用，因此，番茄紅素對神經(jīng)退行性疾病的作用逐漸受到關(guān)注。為了進一步探討番茄紅素的神經(jīng)保護作用，本研究采用線粒體呼吸鏈抑制劑魚藤酮誘導大鼠PC12 細胞凋亡模型，觀察番茄紅素對神經(jīng)元凋亡的抑制作用，以及番茄紅素對細胞凋亡抑制的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 PC12 細胞由中山大學病理教研室惠贈。細胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清的RMPI1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 儀器 流式細胞儀(美國BD 公司)，全自動酶標儀(美國伯樂公司)，熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.1.3 藥品與試劑 番茄紅素、魚藤酮、Hoechst33258 染料、羅丹明123 購自美國Sigma 公司，CCK-8 檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司，其它均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及藥物處理細胞 細胞接種于96 孔板或6 孔板中，24h 貼壁后，加入不同濃度的番茄紅素，使終濃度分別達到3、10、30μmol/L，2h后根據(jù)分組加入魚藤酮，使終濃度達到0.5μmol/L，實驗分5 組:正常對照組、0.5μmol/L 魚藤酮損傷組、3、10、30μmol/L 番茄紅素預理組。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞存活率 細胞以105個/ml－1接種于96 孔板，每孔100μl，每組6 個復孔，按上述方法處理后，細胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μl CCK-8，繼續(xù)孵育2h，酶標儀450nm 測定各孔OD 值。細胞存活率(%)=(實驗組OD－空白組OD)/(對照組OD－空白組OD)×100%。

1.2.3 PC12 細胞凋亡形態(tài)學的觀察 將PC12 細胞接種于六孔板內(nèi)的蓋玻片，待細胞貼壁生長后，各實驗組按上述方法處理24h 后，棄上清，PBS 洗3 次，加入新鮮配置的4%多聚甲醛4℃固定20min，PBS 洗3 次，加終濃度為10μg/ml 的Hoechst33258 染液室溫避光染色30min，PBS 洗3 次，用封片液封片后熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.4 annexin V/PI 流式細胞分析法檢測細胞凋亡 將細胞按106/ml 接種六孔板，待細胞貼壁后按上述方法處理24h 后，棄培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶消化后離心收集細胞，用PBS 洗2 次，用400μl 的annexin V 結(jié)合液懸浮細胞，然后向其中加入5μl 的annexin V-FITC 染色液，輕輕混勻后于4℃避光孵育15min，加入10μl PI 染色液后輕輕混勻于4℃避光孵育5min，立即用流式細胞儀檢測。

1.2.5 線粒體膜電位檢測 細胞以106/ml 接種于6 孔板待細胞貼壁后，藥物處理24h，胰酶消化收集細胞，PBS 洗兩次，將細胞重懸于PBS 中，加羅丹明123 染液，終濃度為10μg/ml，37℃，避光孵育30min(每隔10min 振搖一次)，離心去掉未結(jié)合的羅丹明123 染液，PBS 洗2 次，然后PBS 重懸，用流式細胞儀檢測其熒光強度，以處理組細胞的平均熒光強度與正常對照組細胞的平均熒光強度的比值作為相對跨膜電位。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)應用GraphPad Prism 5.0 軟件進行處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)各組間差異，t 檢驗分析兩兩間差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對魚藤酮誘導的PC12 細胞存活率的影響 與正常對照組相比，0.5μmol/L 魚藤酮作用細胞24h 后，細胞存活率明顯下降(P＜0.05)。不同濃度的番茄紅素預處理均能明顯降低魚藤酮對細胞的毒性作用(P＜0.05)，且具有濃度依賴性(見表1)。

2.2 細胞凋亡的形態(tài)學觀察 經(jīng)Hoechst33258染色，空白對照組可見細胞核出現(xiàn)彌漫、均勻的低強度熒光(見圖1A);0.5μmol/L 魚藤酮作用PC12 細胞后，出現(xiàn)大量的細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或是顆粒狀熒光的凋亡細胞，藍光比較強，且不均勻(見圖1B);3、10、30μmol/L 番茄紅素預處理細胞后，呈固縮狀態(tài)的細胞核數(shù)明顯減少，大部分細胞染色質(zhì)呈均勻的低密度藍光(見圖1C、D、E)，提示番茄紅素可明顯減輕魚藤酮誘導PC12 細胞的凋亡作用。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 結(jié)果顯示，正常對照組組僅有少量凋亡細胞，為3.56%±1.01%。魚藤酮損傷組可見較多的凋亡細胞(23.63%±2.31%)，較空白對照組明顯增多(P＜0.05)。3、10、30μmol/L 番茄紅素預處理細胞后，細胞凋亡分別為18.60%±1.95%、15.90%±1.00%、12.9%±0.82%。較魚藤酮組明顯減少(P＜0.05)，且具有濃度依賴性(見圖2)。

2.4 線粒體膜電位 魚藤酮作用PC12 細胞24h 后，羅丹明123 染色后細胞平均熒光強度明顯減弱，為對照組的(69.56%±0.59%)，表明細胞MMP顯著下降;分別加入3、30、30μmol/L 番茄紅素預處理后，平均熒光強度增強，分別達到對照組的82.49%±1.68%、87.83%±2.29%和92.25%±2.66%)，與魚藤酮組相比均具有顯著性差異(P＜0.05)，表明番茄紅素可抑制魚藤酮引起的細胞膜電位下降。

表1 番茄紅素對魚藤酮所致PC12 細胞存活率的影響(±s，n=4)

表1 番茄紅素對魚藤酮所致PC12 細胞存活率的影響(±s，n=4)

與正常對照組相比* P＜0.05;與魚藤酮損傷組相比#P＜0.05

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)長期暴露在魚藤酮環(huán)境下可以增加患帕金森病風險［4］，環(huán)境因素在PD 發(fā)病中的作用日益受到人們的重視。本實驗選用魚藤酮損傷PC12細胞作為PD 體外模型，研究番茄紅素的神經(jīng)保護作用及其可能的機制，結(jié)果表明魚藤酮可引起PC12細胞活性降低，細胞核改變，發(fā)生凋亡的細胞增多，流式檢測細胞凋亡百分率增加，細胞線粒體膜電位下降，證實魚藤酮有致凋亡的神經(jīng)毒性。

番茄紅素有強抗氧化活性，不管是天然的還是合成的都具有很強的淬滅自由基能力，對體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化和DNA 氧化損傷有防護作用，能保護神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻止神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺及乙酰膽堿的減少，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要的作用。流行病學研究結(jié)果顯示［5］，長期攝入富含番茄紅素的食品能夠有效提高老年人的認知能力和記憶功能，預防多種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生或發(fā)展。Hsiao［6］等報道番茄紅素可以保護大鼠大腦局部缺血造成的神經(jīng)元凋亡并抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥性反應;Kumar［7］等的研究也表明番茄紅素可以抑制3-硝基丙酸誘導的亨廷頓舞蹈癥樣癥狀，其機制與維持線粒體正常功能相關(guān)，Mingyue Qu［8］等的研究同樣表明番茄紅素可以通過抑制了Aβ25-35所致神經(jīng)元細胞活性氧的產(chǎn)生和線粒體膜電位去極化，從而達到對原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元的保護作用。本研究的結(jié)果顯示番茄紅素預處理后細胞凋亡率明顯減少，證實番茄紅素對魚藤酮誘導的PC12 細胞損傷有保護作用。

線粒體是細胞生命活動的控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，也是細胞凋亡的調(diào)控中心，線粒體是凋亡過程中一個重要的調(diào)控器［9］，多數(shù)凋亡發(fā)生過程都伴有線粒體膜電位的異常［10］。線粒體功能障礙可導致ATP 水平的降低、質(zhì)子泵功能受損，進而導致線粒體膜電位的下降，從而啟動細胞凋亡，線粒體功能障礙也被認為是細胞凋亡早期信號之一。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)番茄紅素通過穩(wěn)定線粒體膜電位和改善細胞能量供應從而抑制魚藤酮導致的PC12 細胞損傷的膜電位下降和細胞凋亡的發(fā)生，這可能是番茄紅素神經(jīng)保護作用的機制之一。

圖1 茄紅素對0.5μmol/L 魚藤酮誘導24h 的PC12 細胞凋亡形態(tài)的影響(×100)

圖2 茄紅素對魚藤酮損傷PC12 細胞凋亡率的影響(±s，n=3)

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