申張順，高 倩，程樹(shù)彬，辛立建，劉瑞春，郭 力，董 梅

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要病理改變的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)與人類(lèi)MS 在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)特征及免疫學(xué)機(jī)制等多方面相似，是公認(rèn)的研究MS 的動(dòng)物模型。

CD4+CD25+Treg 細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞亞群，具有抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)疾病緩解等重要作用，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，同樣可抑制EAE 病情進(jìn)展，促進(jìn)疾病恢復(fù)［1］。

研究表明，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞來(lái)自于胸腺，在胸腺中發(fā)育、分化、成熟并輸出到外周免疫環(huán)境，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。一般認(rèn)為，到青春期后，胸腺隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸萎縮退化，其功能亦隨之衰退。新近研究表明:EAE 大鼠可見(jiàn)胸腺萎縮、凋亡加劇等病理學(xué)改變，胸腺在EAE 大鼠發(fā)病中可通過(guò)產(chǎn)生CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，抑制EAE 進(jìn)展［2］。關(guān)于成年期胸腺是否能分化調(diào)節(jié)T 細(xì)胞并進(jìn)一步發(fā)揮抗炎、維持免疫耐受的調(diào)節(jié)作用的認(rèn)識(shí)，目前仍相對(duì)空白。

本研究通過(guò)觀察對(duì)比去胸腺和未去胸腺EAE大鼠發(fā)病過(guò)程，檢測(cè)不同發(fā)病時(shí)期脊髓和脾臟Treg細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，明確胸腺是否在EAE 大鼠發(fā)病中具有免疫調(diào)節(jié)作用并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑器材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar 大鼠(合格證編號(hào):1006151)90 只，6～8 周齡，體重180～200g;雌性豚鼠3 只，體重350～400g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑及儀器 卡介苗60mg/ml(北京生物制品研究所)，兔抗小鼠/大鼠Foxp3 抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，antirat CD4+(FITC)、anti-rat CD25+(PE)，anti-rat Foxp3(PE-CY5)及固定破膜劑(美國(guó)eBioscience 公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter Etics XL)，離心機(jī)(TD5G，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 去胸腺大鼠模型的制備［3］Wistar 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢及頭部，沿前頸部及胸部中線剪開(kāi)皮膚及皮下組織并暴露氣管，沿氣管前間隙于胸骨柄中點(diǎn)剪開(kāi)胸骨約1.5 cm，顯露胸腺上極。用顯微鑷輕輕牽引并分離胸腺兩葉，當(dāng)分離到下極時(shí)即與胸腔相通，此時(shí)迅速游離取下胸腺關(guān)閉胸腔，繼而用10ml 注射器刺入大鼠右側(cè)胸腔，緩緩回抽，一般可抽出胸腔內(nèi)積氣3～5ml，縫合皮下組織及皮膚。同樣方法切開(kāi)胸骨，保留胸腺，制備對(duì)照組假手術(shù)模型。

1.2.2 EAE 動(dòng)物模型的制備［4］及分組 對(duì)去胸腺組大鼠和部分假手術(shù)組大鼠，以豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)為抗原進(jìn)行免疫，建立Wistar 大鼠EAE動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(假手術(shù)大鼠未進(jìn)行免疫)、去胸腺EAE 組和EAE 組(假手術(shù)大鼠進(jìn)行免疫)，每組30 只，各組按發(fā)病時(shí)間及發(fā)病程度分為發(fā)病前期(免疫12d)、發(fā)病高峰期(發(fā)病后3d)和恢復(fù)期(發(fā)病后7d)，每組10 只。

1.2.3 指標(biāo)觀察 免疫當(dāng)天為第0 天，觀察大鼠精神、飲食、體重、二便及肢體活動(dòng)，參照通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0 分:不發(fā)病;1 分:動(dòng)物尾部無(wú)力;2 分:后肢輕度癱瘓+步態(tài)不穩(wěn);3 分:中度癱瘓但自主運(yùn)動(dòng)保存;4 分:肢體嚴(yán)重癱瘓，自主運(yùn)動(dòng)不能;5 分:瀕死狀態(tài)。

1.2.4 標(biāo)本處理 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速取脾臟，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，取脊髓腰膨大組織固定于4%多聚甲醛中，行HE 及免疫組化染色，觀察炎癥改變和脊髓組織中Foxp3的表達(dá)。將脾臟研磨、200 目細(xì)胞篩過(guò)濾制成細(xì)胞懸液，定量，加入抗CD4+、CD25+熒光抗體避光孵育30min，加入破膜劑破膜，加入Foxp3 抗體避光孵育30min 后，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg 細(xì)胞含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組發(fā)病率用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量資料均數(shù)的比較應(yīng)用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物發(fā)病情況的觀察 兩組動(dòng)物均出現(xiàn)食欲不振、皮毛不光滑、體重下降等情況。繼而出現(xiàn)尾部無(wú)力下垂、肢體癱瘓，多數(shù)動(dòng)物為2 個(gè)以上肢體癱瘓，嚴(yán)重者出現(xiàn)瀕死狀態(tài)。EAE 組大鼠病情達(dá)高峰后，癥狀逐漸緩解，極少動(dòng)物遺留后遺癥狀，去胸腺組大鼠發(fā)病率高于EAE 組(P＜0.05)，且癱瘓程度更重，癥狀持續(xù)，不能隨病程緩解，神經(jīng)功能評(píng)分顯著高于EAE 組(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 組織病理學(xué)改變 對(duì)照組各時(shí)期脊髓組織內(nèi)均未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。去胸腺組和EAE 組在發(fā)病前期均可見(jiàn)少量散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)比無(wú)明顯差異。去胸腺組發(fā)病第3 天和第7 天均可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和多處“血管袖套”現(xiàn)象，均較EAE組程度嚴(yán)重，EAE 組發(fā)病第7 天較第3 天炎性細(xì)胞明顯較少，“血管袖套”基本消失(見(jiàn)圖1)。

2.3 脊髓Foxp3 表達(dá) 對(duì)照組不同時(shí)期脊髓組織Foxp3 少量表達(dá)(P＞0.05)。去胸腺組和EAE組Foxp3 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目隨疾病進(jìn)展均增高(P＜0.05)，不同時(shí)期EAE 組表達(dá)量均高于同時(shí)期去胸腺組(P＜0.05)，且兩組表達(dá)量均高于對(duì)照組(P＜0.05)(見(jiàn)表2)。

2.4 脾臟CD4+CD25+Foxp3+T 的細(xì)胞含量對(duì)照組不同時(shí)期脾臟組織Foxp3 細(xì)胞含量無(wú)差異(P＞0.05)。去胸腺組EAE 組Foxp3 細(xì)胞含量隨病情發(fā)展均增高(P＜0.05)，不同時(shí)期EAE 組的Foxp3 含量均高于同時(shí)期的去胸腺組(P＜0.05)，且兩組Foxp3 的細(xì)胞含量均高于對(duì)照組(P＜0.05)(見(jiàn)表3)。

表1 各組發(fā)病率和神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s)

表1 各組發(fā)病率和神經(jīng)功能評(píng)分比較(±s)

胸腺切除組與EAE 組比較* P＜0.05;7d 組與3d 組比較#P＜0.05

表2 不同組脊髓Foxp3 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)比較(±s)

表2 不同組脊髓Foxp3 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)比較(±s)

與對(duì)照組比較* P＜0.05;3d 組與發(fā)病前組比較#P＜0.05;胸腺切除組與EAE 組比較▽P＜0.05;7d 組與3d 組比較△P＜0.05

表3 不同組脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg 含量(%)比較

3 討論

MS 的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，目前的資料多認(rèn)為是由CD4+T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)自身髓鞘抗原免疫應(yīng)答及繼發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷中樞神經(jīng)白質(zhì)所致。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，即Treg 細(xì)胞在自身免疫應(yīng)答的免疫負(fù)調(diào)節(jié)及自身免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，可分為胸腺來(lái)源的自然調(diào)節(jié)T 細(xì)胞(nTR)和誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞(iTR)［5］。Foxp3 是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，對(duì)CD4+CD25+T 細(xì)胞發(fā)育和功能起到很重要的調(diào)控作用［6］。Kim［7］等學(xué)者證實(shí)，F(xiàn)oxp3 高度選擇表達(dá)于CD4+CD25+T 細(xì)胞，是CD4+CD25+T 細(xì)胞的重要標(biāo)志，也是鑒定Treg 細(xì)胞的重要標(biāo)志。CD4+CD25+T 細(xì)胞在維持外周免疫耐受、預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在MS 疾病活動(dòng)期，CD4+CD25+T 細(xì)胞在患者外周血中的數(shù)量較非活動(dòng)期明顯減少，F(xiàn)oxp3mRNA 的表達(dá)量也顯著降低［8］。雷帕霉素可通過(guò)增加EAE 大鼠外周淋巴器官脾臟中CD4+CD25+Foxp3 細(xì)胞含量，從臨床和病理兩方面明顯減輕疾病的發(fā)生［9］。Th17 細(xì)胞是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的參與MS 發(fā)病的另一類(lèi)T 淋巴細(xì)胞，通過(guò)分泌IL-17等細(xì)胞因子破壞血腦屏障，募集炎癥細(xì)胞進(jìn)入CNS，破壞髓鞘和軸索［10］。在EAE 發(fā)病中，Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞共同參與調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫過(guò)程，二者的平衡關(guān)系決定了疾病的發(fā)展方向，Th17 細(xì)胞功能亢進(jìn)、Treg 細(xì)胞功能低下是導(dǎo)致MS 發(fā)病的關(guān)鍵所在［11，12］。CD4+CD25+T 細(xì)胞在抑制EAE 疾病的發(fā)展以及促進(jìn)其恢復(fù)緩解方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

胸腺是機(jī)體最重要的中樞免疫器官，在維持機(jī)體正常免疫功能和免疫耐受機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。胸腺在調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T 細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程中占有十分重要的地位。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，切除出生后3d 小鼠的胸腺可誘使其患多種自身免疫疾病如自身免疫性腸炎等［13］，在其體內(nèi)檢測(cè)不到CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞的存在，或含量極低，向其輸注CD4+CD25+T 細(xì)胞則可防止自身免疫疾病的發(fā)生，表明CD4+CD25+T 細(xì)胞是在胸腺中發(fā)育分化，并輸注到外周淋巴器官及組織，進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，在個(gè)體發(fā)育早期，CD4+CD25+T 細(xì)胞自胸腺輸出到外周淋巴組織中后，即通過(guò)自身的擴(kuò)增膨脹建立天然CD4+CD25+T 細(xì)胞群，而不再需要胸腺補(bǔ)充作用。到青春期以后，胸腺隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸出現(xiàn)重量、形態(tài)以及功能的退化，T 細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程受阻，生成數(shù)量減少，不再是機(jī)體的主要免疫器官，其免疫調(diào)節(jié)作用亦隨之減弱。但Tsunoda［14］研究表明:大鼠發(fā)生EAE 后，可以見(jiàn)到胸腺出現(xiàn)萎縮、腫脹、凋亡加劇等病理學(xué)異常及生成的T 淋巴細(xì)胞功能受損等情況。在其胸腺中仍可以檢測(cè)到大量CD4+CD25+T 細(xì)胞及Foxp3mRNA。因此，我們推斷，在發(fā)生自身免疫疾病過(guò)程中，胸腺仍可輸出Treg 細(xì)胞，抑制自身免疫損傷，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，去胸腺組大鼠發(fā)病率高、臨床癥狀嚴(yán)重且不能緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度重，脊髓中Foxp3+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及脾臟中CD4+CD25+Treg 細(xì)胞含量均較EAE 組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明成年期胸腺確實(shí)在降低EAE 大鼠發(fā)病率、減輕神經(jīng)功能損傷及促進(jìn)病情緩解等方面發(fā)揮著極其重要的作用。EAE 組大鼠隨疾病發(fā)生和進(jìn)展，胸腺中CD4+CD25+Treg 細(xì)胞動(dòng)員輸出增加，在數(shù)量和功能上得到上調(diào)，通過(guò)其接觸抑制和分泌抑炎細(xì)胞因子作用，抑制效應(yīng)細(xì)胞功能，抑制炎癥發(fā)展，疾病發(fā)展得到抑制并逐漸緩解。而去胸腺組大鼠在發(fā)病過(guò)程中，雖然其脊髓中Foxp3+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及其脾臟中CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞含量有相對(duì)升高，但失去了胸腺的免疫調(diào)節(jié)作用。促炎因素一直處于主導(dǎo)地位，致使其發(fā)病癥狀重于EAE 組，而且喪失了疾病恢復(fù)緩解能力。

Van［15］等研究支持EAE 小鼠出現(xiàn)胸腺損傷及輸出Treg 細(xì)胞減少，通過(guò)增加Treg 細(xì)胞可以改善EAE發(fā)病。因此，胸腺不僅是T 細(xì)胞發(fā)育器官，而且是重要的免疫調(diào)節(jié)器官，并參與免疫耐受形成。在EAE 大鼠發(fā)病過(guò)程中，胸腺能通過(guò)動(dòng)員輸出CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞到外周免疫環(huán)境和靶器官中，抑制炎癥進(jìn)展，促進(jìn)疾病恢復(fù)，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

圖1 各組脊髓HE 染色比較(HE，200×)

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