高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基

王薇，劉明東，顏有儀，葉懿，趙俊紅，熊卉，肖敏，廖林川

（1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川成都 610041；2.四川大學華西藥學院，四川成都 610041）

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基

王薇1，劉明東2，顏有儀1，葉懿1，趙俊紅2，熊卉1，肖敏1，廖林川1

（1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川成都 610041；2.四川大學華西藥學院，四川成都 610041）

目的 建立靈敏、準確的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（HPLC-MS/MS）測定肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法。方法肝組織勻漿液中加入內標地塞米松，用二氯甲烷提取后揮干，殘渣加入甲醇溶液溶解并上樣到ProElut C18固相萃取柱上分離凈化，應用HPLC-MS/MS正離子多反應監(jiān)測模式測定。結果肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基分別在1～204 ng/g和1～206 ng/g范圍內線性關系良好。檢測限（S/N≥3）均為0.3ng/g。基質效應為96.5%～126.7%。萃取回收率為70.0%～82.3%。日內及日間精密度均小于10%。結論所建方法靈敏、可靠，能滿足法醫(yī)毒物分析的鑒定需要。

法醫(yī)毒理學；串聯(lián)質譜法；高效液相色譜法；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基

華蟾酥毒基和酯蟾毒配基為蟾酥（由蟾蜍動物頭、舌、肝、膽、耳后腺及皮膚腺的白色分泌物加工而成的固狀物）毒基類的主要毒性成分，基本結構為具有六元不飽和內酯環(huán)的甾體化合物，是一類乙型強心苷元的衍生物。蟾酥具有消腫、鎮(zhèn)痛、強心、抗感染、抗腫瘤等功效，可內服和外用，被廣泛用于傳統(tǒng)復方中藥制劑中。然而，蟾酥具有較強心臟毒性和細胞毒性，治療量和致死量相近，安全系數(shù)低，且中毒癥狀出現(xiàn)時間短。因此，偶有服用含蟾酥中藥或捕食蟾蜍造成中毒或死亡的案例報道[1-2]。

文獻[3-7]報道各類復方中藥制劑中蟾酥毒基類成分測定方法較多，有高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法（HPLC-MS）等。生物檢材中蟾酥毒基類成分的測定也有報道，研究對象多選用血液[8-13]，然而蟾酥毒基類成分在血液中代謝速度快、消除半衰期短，在實際法醫(yī)學鑒定工作中，血液并不是最合適的檢材。與血液相比，選擇全身最大代謝器官的肝作為檢材更合理。目前僅有HPLC法檢測肝組織中蟾酥毒基類成分的報道[14-15]，由于蟾酥中毒劑量小，組織中檢測難度高，需要靈敏度更高的檢測方法。因此，本研究選擇液-固萃取結合固相萃取的樣品前處理方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（HPLCMS/MS）對肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基進行定性定量分析，并將此方法用于蟾酥中毒案件的鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent G6410A三重串聯(lián)四極桿質譜儀配Agilent 1200液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司），VisiprepTM固相萃取儀（美國Supelco公司），ProElut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL，北京迪馬科技有限公司）。

華蟾酥毒基對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110803-200605，含量按純品計），酯蟾毒配基對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110718-201102，含量98.9%），地塞米松對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100129-200804，含量99.6%），二氯甲烷（色譜純）、甲醇（色譜純），去離子水經(jīng)優(yōu)普純水系統(tǒng)制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18液相色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流動相及梯度洗脫條件見表1；柱溫：30℃；流速：0.3mL/min。

表1 梯度洗脫條件

1.3 質譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源，正離子模式；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9.0 L/min；霧化氣壓力：275.8 kPa；毛細管出口電壓：4 000 V，采用多反應監(jiān)測模式（MRM）。檢測離子為華蟾酥毒基m/z 443.2→187.0（定量離子）、365.0，酯蟾毒配基m/z 385.2→105.0（定量離子）、349.0，內標地塞米松m/z 393.1→373.2（定量離子）、355.2。

1.4 標準溶液配制

精密稱取華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松對照品各適量，用甲醇分別配制成1.02、1.03和1.05mg/mL的儲備液，4℃冰箱保存。臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。

1.5 樣品預處理

稱取空白勻漿肝組織1 g，向內加入100 μL 0.84μg/mL地塞米松甲醇溶液（內標），混勻，用12mL二氯甲烷分3次提取，每次渦旋混合5 min，2 432×g離心5min，取下層提取液，合并提取液，置于40℃氮氣流下吹干。殘渣用100 μL甲醇溶解，并加入5 mL去離子水混勻，將上清液上樣到ProElut C18固相萃取柱，依次用3mL去離子水和2mL 10%甲醇溶液洗去雜質，用3mL二氯甲烷洗脫待測組分，洗脫液置于40℃氮氣流下吹干，殘渣用0.5mL甲醇溶解，9576×g離心10min后，取上清液10μL進樣分析。

1.6 工作曲線、檢測限和定量限考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，加入系列質量濃度華蟾酥毒基對照品溶液（0.010 2、0.020 4、0.051、0.102、0.204、0.510、1.02、2.04μg/mL）和酯蟾毒配基對照品溶液（0.0103、0.0206、0.0515、0.103、0.206、0.515、1.03、2.06μg/mL）各100μL，按照1.5項方法處理，在選定條件下進行分析，分別以華蟾酥毒基和酯蟾毒配基與內標峰面積的比值（y）對質量分數(shù)（x）進行線性回歸，以S/N≥10時的質量分數(shù)為定量限，以S/N≥3時的質量分數(shù)為檢測限。

1.7 精密度考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，添加華蟾酥毒基對照品溶液（0.051、0.204、1.02 μg/mL）和酯蟾毒配基對照品溶液（0.0515、0.206、1.03 μg/mL）各100 μL，制得低、中、高質量分數(shù)的質控樣品，每一質量分數(shù)5份，按照1.5項方法處理，在選定條件下進行分析。在同一天內每一質量分數(shù)重復測定5份質控樣品，同法連續(xù)測定3d，得日內精密度和日間精密度。

1.8 萃取回收率和基質效應考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，添加低、中、高質量分數(shù)的華蟾酥毒基對照品溶液和酯蟾毒配基對照品溶液，按照1.7項質量濃度制備，每一質量分數(shù)5份，按照1.5項方法處理，以質控樣品中待測物峰面積與空白檢材經(jīng)提取凈化后添加得相應質量濃度的待測物峰面積比得到萃取回收率。

取空白勻漿肝組織若干份各1g，按照1.5項方法提取凈化后，將洗脫液置于40℃氮氣流下?lián)]干，添加低、中、高質量濃度的華蟾酥毒基對照品溶液和酯蟾毒配基對照品溶液，按照1.7項質量濃度制備，置于40℃氮氣流下?lián)]干，殘渣用0.5mL甲醇定容，9576×g離心10min后進樣分析。以空白肝提取凈化后添加樣品峰面積與相應質量濃度對照品溶液峰面積比得到基質效應。

1.9 穩(wěn)定性考察

取空白勻漿肝組織若干份各1 g，添加低、中、高質量分數(shù)的華蟾酥毒基對照品溶液和酯蟾毒配基對照品溶液，按照1.7項質量濃度制備，再按照1.5項方法處理后，分別將樣品置于室溫20～25℃中放置0、4、8h及-20℃放置0、1、3d后取樣測定，考察實驗條件下樣品的穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 色譜及質譜圖

在上述選定的色譜條件下，肝組織添加樣品中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松分離良好，保留時間分別為7.709、8.130和4.541 min，HPLC-MS/MS總離子流圖見圖1，華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松的二級質譜圖見圖2。

圖1 華蟾酥毒基（A）、酯蟾毒配基（B）和地塞米松（C）的HPLC-MS/MS總離子流圖

圖2 華蟾酥毒基、酯蟾毒配基和地塞米松的二級質譜圖

2.2 線性方程、檢測限和定量限

肝組織中華蟾酥毒基在1～204 ng/g范圍內線性關系良好（r=0.9995），線性方程為y=4.7377x+0.0122，檢測限為0.3ng/g，定量限為1.02ng/g；酯蟾毒配基在1～206 ng/g范圍內線性關系良好（r=0.999 8），線性方程為y=6.7222x+0.0188，檢測限為0.3ng/g，定量限為1.03ng/g。

2.3 精密度

肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高質量分數(shù)的質控樣品的精密度見表2。結果顯示，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的日內精密度均小于3%，日間精密度均小于10%，方法精密度良好。

2.4 萃取回收率和基質效應

肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基低、中、高質量分數(shù)的質控樣品的萃取回收率和基質效應見表3，結果表明，肝組織中低、中、高質量分數(shù)華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的基質效應為96.5%～126.7%，萃取回收率為70.0%～82.3%。

表2 肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的精密度

表3 肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的基質效應和萃取回收率

2.5穩(wěn)定性

穩(wěn)定性考察結果顯示，于室溫20～25℃中放置4、8h的低、中、高質量分數(shù)的質控樣品與放置0h相比，肝組織中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量測定相對偏差均小于5%，而于-20℃放置1、3d與0d相比，相對偏差均小于10%，能夠達到生物檢材的分析要求，確保測定結果的準確性。

2.6 案例應用

某年3月13日，一名59歲婦女服用含蟾酥成分的中藥丸后出現(xiàn)不適，約3.5h后死亡。半年后取死者肝組織用本研究所建方法檢驗，檢出華蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分，其中華蟾酥毒基質量分數(shù)為1.81ng/g。

在死者肝組織中也檢出酯蟾毒配基，但未達到定量限?？赡苁怯捎隗杆种滤懒枯^低，而檢材送檢時間與死者死亡時間相距已有半年，酯蟾毒配基發(fā)生降解，以及肝組織腐敗等原因造成的。

3 討論

3.1 樣品預處理條件的選擇

本研究曾考察采用肝組織勻漿高速離心后，取上清液直接進行固相萃取的前處理方法，結果發(fā)現(xiàn)在色譜分析中，待測組分保留時間點共流出組分較多，即使調整流動相比例也不能優(yōu)化分離，嚴重影響了離子化效率，且勻漿后取上清液上樣，萃取回收率僅為30%～40%。因此考慮在固相萃取之前增加液-固萃取的步驟，最終的分析結果顯示優(yōu)化后的萃取回收率提高到了70.0%以上。

在液-固萃取溶劑的選擇方面，考察了乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷3種溶劑。結果表明，乙醚和乙酸乙酯會提出較多油脂成分，提取液難以揮干，二氯甲烷極性較大，能相對減少對油脂類成分的提取，減少雜質干擾，提取液揮干時間也較短。

結合文獻[16]報道蟾酥毒基類在甲醇和二氯甲烷中溶解度最好，考察了甲醇和二氯甲烷為洗脫溶劑的情況，結果表明，甲醇洗脫液中雜質較多，回收率為60%左右，而二氯甲烷比甲醇能減少對雜質的洗脫，降低共流出組分的干擾，回收率更高。預試驗分段收集了前、中、后段各3mL洗脫液，結果顯示，前段洗脫液中兩種待測組分回收率分別為80%和73%，中、后段洗脫液中均未檢出兩種待測組分。

結合以上研究結果，選擇二氯甲烷為液-固萃取溶劑和洗脫溶劑，洗脫體積為3mL。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究比較了甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液兩種流動相系統(tǒng)，結果顯示，相對于乙腈-0.1%甲酸溶液，雖然甲醇-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)響應高約20%，但柱壓較高，最高可達45 MPa，待測組分的峰形較差，影響了兩種待測組分的分離度，因此綜合考慮，選擇乙腈-0.1%甲酸溶液流動相系統(tǒng)。由于待測組分極性較小，需要用大比例有機相洗脫，等度洗脫情況下峰分離度較差，因此選用梯度洗脫的方法分離待測組分。本研究同時考察了30、40和50℃下待測組分的色譜行為，最終結果顯示無明顯差別。

3.3 內標的選擇

結合蟾酥毒基類的化學結構和理化性質，考察了兩種甾體化合物地塞米松和潑尼松龍作為內標的情況，結果顯示兩者回收率均為75%～80%，與待測物近似且穩(wěn)定，而地塞米松在選定的試驗條件下保留時間與待測物更接近，因此選擇地塞米松作為內標。

綜上，本研究所建立的運用HPLC-MS/MS法檢測肝組織中兩種蟾酥毒基成分的方法，靈敏、可靠，與參考文獻[12-13]相比，在定量限及檢測限方面都有了較大進步，適用于法醫(yī)毒物分析鑒定工作。

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Determination of Cinobufagin and Resibufogenin in Liver Tissue by HPLC-MS/MS

WANG Wei1,LIU Ming-dong2,YAN You-yi1,YE Yi1,ZHAO Jun-hong2,XIONG Hui1,XIAO Min1,LIAO Lin-chuan1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China; 2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China）

ObjectiveTo develop a sensitive and accurate assay for detecting cinobufagin and resibufogenin in liver tissue using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）. Methods The homogenization of liver tissue with internal standard dexamethasone was extracted with dichloromethane.The extracts with methanol were purified through ProElut C18solid phase extraction and tested in positive electrospray ionization with multiple reaction monitoring of HPLC-MS/MS.ResultsThe good linear relationship of cinobufagin and resibufogenin in liver tissue were 1-204ng/g and 1-206ng/g, respectively.The minimal detection threshold（S/N≥3）of this method was 0.3ng/g for both cinobufagin and resibufogenin.The matrix effect was 96.5%-126.7%.The extraction recovery coefficient was 70.0%-82.3%. The precision of intra-day and inter-day was less than 10%.ConclusionThis method is sensitive and reliable,and can be used in forensic toxicological analysis.

forensic toxicology;tandem mass spectrometry;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;cinobufagin;resibufogenin

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.008

1004-5619（2013）04-0268-05

2012-10-16）

（本文編輯：劉偉）

王薇（1986—），女，四川瀘州人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)毒物分析研究；E-mail：freja_v@163.com

廖林川，男，博士，教授，主要從事法醫(yī)毒物分析教學及科研工作；E-mail：linchuanliao@scu.edu.cn