李亞平， 玉崧成， 于 斐， 吳擁軍， 張洪權(quán)

(1．鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河南鄭州450001;2．鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南鄭州450001)

0 引言

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是全球性污染谷物的霉菌毒素之一，大量存在于小麥、玉米等谷物以及谷物類制品中［1］．DON能引起食欲下降、器官損傷、代謝紊亂以及生長抑制等癥狀［2－3］，對免疫功能以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生明顯的影響［4］．另外還具有致畸、胚胎毒性，可能是一種潛在的致癌物質(zhì)［5－7］．DON的危害已引起不少國家的重視，我國的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2011(食品中真菌毒素限量)中規(guī)定谷物及其制品中的DON最高限量為1 mg/kg．目前測定谷物中DON常用的方法主要包括薄層色譜［8］、酶聯(lián)免疫［9］、氣相色譜［10］、液相色譜［11］以及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等［12－14］．我國食品中 DON 的測定為免疫親和層析凈化高效液相色譜法(GB/T 23503—2009)，谷物及其制品中DON的測定為薄層色譜測定方法及免疫測定方法(GB/T 5009．111—2003)．作者建立了測定DON含量的ELISA和HPLC法，并對這兩種方法進(jìn)行了方法學(xué)比較．

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

DON單克隆抗體(Envirlogix);DON標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司);HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(上海佑隆生物科技有限公司);顯色劑A、顯色劑B(河南華美生物公司);嘔吐毒素免疫層析親和柱(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為分析純．

高效液相色譜儀系統(tǒng)(美國戴安公司);酶標(biāo)儀(WELLSCAN MK3，Thermo);UV-1606紫外分光光度儀(日本島津);FW-100型高速萬能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);快速混勻器(XK96-A，姜堰市新康醫(yī)療機(jī)械有限公司)．

1．2 間接競爭ELISA法

(1)一抗、二抗稀釋液和封閉液的考察 以引入無關(guān)蛋白盡可能少的原則，對1%OVA的PBS、1．25%OVA的CB、0．02%BSA的PBS和10%NBS的PBS這四種常用一抗、二抗稀釋液和封閉液優(yōu)化，根據(jù)吸光度的大小選擇1%OVA的PBS作為一抗、二抗稀釋液和封閉液．

(2)抗體和包被抗原工作濃度的考察 分別將抗體和包被抗原進(jìn)行倍比稀釋，通過競爭棋盤滴定實(shí)驗(yàn)，選擇抗體最佳濃度12 μg/mL、包被抗原1∶8稀釋為最佳條件．

(3)最佳實(shí)驗(yàn)條件的考察 通過正交試驗(yàn)對最佳包被條件、一抗及二抗孵育時(shí)間進(jìn)行考察，選擇對抗原結(jié)合反應(yīng)抑制率高、吸光度大、適合快速檢測的組合．最終選取包被條件是4℃過夜(12 h)，一抗最佳孵育時(shí)間是60 min，二抗最佳孵育時(shí)間是60 min．

(4)樣品前處理 將待測玉米(小麥)樣品用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過300目的分子篩，用四分法稱取5 g通過分子篩的待測樣品于250 mL錐形瓶中，加入25 mL 10%的乙腈－水提取液．置于快速混勻器上震蕩10 min，過濾，收集濾液．取適量濾液或其稀釋液進(jìn)行ELISA檢測分析．

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制一系列質(zhì)量濃度為10、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL 的 DON，以 DON質(zhì)量濃度的對數(shù)log C為橫坐標(biāo)(x)，以DON標(biāo)準(zhǔn)樣品各濃度孔的吸光度為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1．3HPLC 法

(1)色譜條件 參照GB/T 23503—2009食品中DON的測定(免疫親和層析凈化高效液相色譜法)，選擇色譜實(shí)驗(yàn)條件如下:色譜柱為Agilent XDB－C18柱(5 μm，4．6 mm×250 mm);流動相為甲醇－水(體積比20∶80);流速為0．8 mL/min;柱溫為35℃;進(jìn)樣量為20 μL;檢測波長為218 nm;檢測器為紫外檢測器．

(2)樣品前處理 將待測玉米(小麥)樣品用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過300目的分子篩，用四分法稱取25 g通過分子篩的待測樣品于100 mL容量瓶中，加入5 g聚乙二醇8 000，用水定容至刻度線．置于快速混勻器上震蕩10 min，過濾至濾液澄清，收集濾液．

(3)樣品濾液的凈化與洗脫 準(zhǔn)確移取濾液2．0 mL，參照DON免疫親和柱說明書進(jìn)行凈化、洗脫．收集全部洗脫液用于HPLC檢測分析．

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用流動相稀釋 DON 標(biāo)準(zhǔn)品母液至質(zhì)量濃度分別為0．1、0．2、0．5、1．0、2．0和5．0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以DON標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

2 結(jié)果與分析

2．1 間接競爭ELISA法的方法學(xué)考察

(1)線性回歸方程 在10～1 000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=－0．332 9x+2．750 7，相關(guān)系數(shù) r= －0．981 3．

(2)靈敏度 測定陰性孔10次，計(jì)算陰性孔平均值(A陰)及標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)，根據(jù)公式A=A陰－2SD，計(jì)算出分析檢測限為 0．043 μg/mL．

(3)實(shí)際樣品的準(zhǔn)確度及精密度 分別向經(jīng)前處理且其含量已知的小麥和玉米樣品中添加一定質(zhì)量濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)品，配成高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度測定6次，結(jié)果如表1所示．玉米的平均回收率為96．8%，RSD的平均值為8．8%;小麥的平均回收率為97．3%，RSD的平均值為4．4%．

表1 ELISA法的回收率結(jié)果(n=6)Tab．1 Results of recoveries by ELISA

2．2 HPLC法的方法學(xué)考察

(1)線性回歸方程 在0．1～5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0．570 1x+0．036 4，相關(guān)系數(shù) r=0．998 7．

(2)靈敏度 將DON標(biāo)準(zhǔn)品母液逐級稀釋，直到信號值與噪音值之比為3∶1時(shí)，確定此時(shí)信號值對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為HPLC法的檢測限．實(shí)驗(yàn)測定的DON檢測限為0．1 μg/mL．

(3)實(shí)際樣品的準(zhǔn)確度及精密度 分別向經(jīng)前處理且其含量已知的小麥和玉米樣品中添加一定質(zhì)量濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)品，配成高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度測定6次，結(jié)果如表2所示．玉米的平均回收率為92．7%，RSD的平均值為6．8%;小麥的平均回收率為92．7%，RSD的平均值為3．1%．

表2 HPLC法的回收率結(jié)果(n=6)Tab．2 Results of recoveries by HPLC

2．3 兩種檢測方法測定結(jié)果的比較

(1)靈敏度比較 ELISA 法的檢測限為0．043 μg/mL，HPLC 法的檢測限為0．1 μg/mL．由此可知，ELISA法檢測限低，靈敏度高．

(2)準(zhǔn)確度比較 由表1和表2可知，ELISA法對實(shí)際樣品的回收率較好，準(zhǔn)確度高．相對而言HPLC法回收率低，準(zhǔn)確度低，這可能與HPLC法前處理的復(fù)雜程序有關(guān)．

(3)精密度比較 將兩種方法高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度RSD的平均值進(jìn)行方法學(xué)的比較，可知兩種方法的精密度沒有顯著性差異．

3 結(jié)論

由ELISA和HPLC方法學(xué)數(shù)據(jù)比較得出，ELISA法簡便快速，其靈敏度高于HPLC法，能夠?qū)任镱惣Z食中的微量DON進(jìn)行監(jiān)測．ELISA法回收率高，這可能是由于HPLC前處理極其復(fù)雜，處理過程會造成待測毒素一定程度的損失，從而造成HPLC法回收率偏低．ELISA和HPLC法的精密度沒有顯著性差異，在實(shí)驗(yàn)中都可以通過更加規(guī)范化的操作來提高精密度．

綜上可知，ELISA法不需要繁雜的前處理，可以批量快速檢測，且具有高靈敏度和準(zhǔn)確度．HPLC樣品前處理過程復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，所需設(shè)備昂貴．所以ELISA法在現(xiàn)場快速檢測谷物中DON含量方面更具有優(yōu)勢．

［1］ Ruiz M J，F(xiàn)ranzova P，Juan-García A，et al．Toxicological interactions between the mycotoxins beauvericin，deoxynivalenol and T-2 toxin in CHO-K1 cells in vitro［J］．Toxicon，2011，58(4):315 －326．

［2］ Sato I，Ito M，Ishizaka M，et al．Thirteen novel deoxynivalenol-degrading bacteria are classified within two genera with distinct degradation mechanisms［J］．FEMS Microbiol Lett，2012，327(2):110 － 117．

［3］ Pestka J J．Deoxynivalenol:mechanisms of action，human exposure，and toxicological relevance ［J］．Arch Toxicol，2010，84(9):663－679．

［4］ Girardet C，Bonnet M S，Jdir R，et al．Central inflammation and sickness-like behavior induced by the food contaminant deoxynivalenol:a PGE2-independent mechanism［J］．Toxicol Sci，2011，124(1):179 －191．

［5］ Pestka J J．Toxicological mechanisms and potential health effects of deoxynivalenol and nivalenol［J］．World Mycotoxin Journal，2010，3(4):323 －347．

［6］ Moon Y，Kim H K，Suh H，et al．Toxic alterations in chick embryonic liver and spleen by acute exposure to fusarium-producing mycotoxin deoxynivalenol［J］．Biol Pharm Bull，2007，30(9):1808 － 1812．

［7］ Ma Yiyi，Guo Hongwei．Mini-review of studies on the carcinogenicity of deoxynivalenol［J］．Environmental Toxicology and Pharmacology，2008，25(1):1 －9．

［8］ 金秀娟，朱旭東．脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測［J］．糧食加工，2010，35(3):87－89．

［9］ Lattanzio V M T，Nivarlet N，Lippolis V，et al．Multiplex dipstick immunoassay for semi-quantitative determination of Fusarium mycotoxins in cereals［J］．Analytica Chimica Acta，2012，718(9):99 －108．

［10］ Hallier A，Celette F，David C．Effects of sampling and extraction on deoxynivalenol quantification［J］．Food Chemistry，2011，127(1):303－307．

［11］ Setyabudi F M C S，Nuryono N，Wedhastri S，et al．Limited survey of deoxynivalenol occurrence in maize kernels and maizeproducts collected from Indonesian retail market［J］．Food Control，2012，24(1/2):123 － 127．

［12］ Zou Zhongyi，He Zhifei，Li Hongjun，et al．Development and application of a method for the analysis of two trichothecenes:deoxynivalenol and T-2 toxin in meat in China by HPLC-MS/MS［J］．Meat Science，2012，90(3):613 －617．

［13］ Tran S T，Smith T K，Girgis G N，et al．A survey of free and conjugated deoxynivalenol in the 2008 corn crop in Ontario，Canada［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92(1):37 －41．

［14］高軍俠，萬昊雷，劉作新．Florisil柱凈化玉米、水稻及糙米中黃曲霉毒素的最優(yōu)化條件研究［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版，2005，37(2):101 －103．