劉艷霞，李想，蔡劉體，蘭黔貴，石俊雄

貴州煙草科學(xué)研究院，土肥植保研究中心，貴州貴陽云潭北路，550000

近年來，隨著科技進(jìn)步和人們環(huán)保意識的加強(qiáng)，對煙草青枯病進(jìn)行生物防控越來越引起科研工作者的高度重視[1-2]。生物防控主要通過接種拮抗菌、施用有機(jī)肥或使用含有拮抗菌的生物有機(jī)肥等措施調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境、改善土壤生物活性、抑制病原菌的生長或提高植物自身抗性，從而抑制土傳病害的發(fā)生[3-5]。植物抗性酶活性的高低是作物系統(tǒng)抗性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，它的誘導(dǎo)產(chǎn)生是植物重要的生理生化抗性機(jī)制之一[6-7]。Jetiyanon[8]研究表明作物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性的增加是由于根際復(fù)合菌劑的誘導(dǎo)作用所致，而在Zhao等[9]的研究中，施用生物有機(jī)肥后，甜瓜葉片的POD和SOD的活性都比對照降低。生物有機(jī)肥能夠直接為土壤微生物提供有機(jī)能源，通過改善作物營養(yǎng)和根際土壤環(huán)境促進(jìn)微生物的繁衍并延緩?fù)寥牢⑸锏乃p速率，使其長時間保持旺盛的生命活力，并能夠激活脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、過氧化氫酶等土壤有益酶的生物活性，進(jìn)而防控病害的發(fā)生[10]。另外，植株在逆境中的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理都會發(fā)生變化[11]。當(dāng)烤煙受到煙草花葉病毒侵染后，由于煙株不能及時清除活性氧，引起質(zhì)膜傷害，最終導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)破壞[12]。但對于煙草超微結(jié)構(gòu)變化的研究多集中在水分協(xié)迫[13]或調(diào)制過程中[14]，對于青枯病和生物有機(jī)肥引起的維管束變化報(bào)道甚少。本試驗(yàn)以煙草青枯病拮抗菌發(fā)酵的生物有機(jī)肥BOF為生防材料，檢驗(yàn)其在煙草連作土壤上對煙草青枯病的防治效果, 并從其對煙株抗性產(chǎn)生和阻止青枯病在維管束中的毒害兩方面闡述拮抗微生物有機(jī)肥料的防控機(jī)理，進(jìn)而為防控?zé)煵萸嗫莶〉难芯刻峁├碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙草種子采用易感青枯病品種MS云煙87。

拮抗菌采用本實(shí)驗(yàn)室篩選的L-25（短短芽孢桿菌，Brevibacillus brevis，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（CGMCC No.3175））和L-9(婁徹氏鏈霉菌，Streptomyces rochei)，兩株拮抗菌均分離自安徽省健康煙草根際土壤；有機(jī)肥載體為菜粕酶解的氨基酸有機(jī)肥與牛糞以1:1（質(zhì)量比）混合，含有機(jī)質(zhì)33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O52.26%、K2O 1.08%，由江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥的制備

將拮抗菌L-25接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，L-9接種于高氏一號液體培養(yǎng)基， 30 ℃、170 rpm振蕩48 h。發(fā)酵液6000×g離心10 min，收集菌體。按5%接種量將菌體接種于滅菌后的有機(jī)肥載體。調(diào)節(jié)有機(jī)肥含水量為40%，發(fā)酵5-6天。發(fā)酵結(jié)束后，通過稀釋平板梯度計(jì)數(shù)[15]和熒光定量PCR測定L-25生物有機(jī)肥有效活菌數(shù)及拮抗菌數(shù)量（表1）。L-9計(jì)數(shù)采用婁徹氏鏈霉菌選擇性培養(yǎng)基：在高氏一號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入5 μg·mL-1的苯唑西啉（Oxacillin）、30 μg·mL-1的頭孢噻肟（Cefotaxime sodium salt）、50 μg·mL-1的 氨 曲 南（Aztreonam）、200 μg·mL-1的諾氟沙星（Nor fl oxacin）和20 μg·mL-1的哌拉西林（Piperacillin），作為拮抗菌L-9選擇性培養(yǎng)基。

每克樣品的菌數(shù)＝同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)

熒光定量PCR方法測定肥料中短短芽孢桿菌L-25數(shù)量。拮抗菌數(shù)量為L-9和L-25數(shù)量之和。

土壤或肥料總DNA采用Soil DNA Isolation Kit(Omega) 提取，以樣品DNA作為擴(kuò)增模板，用拮抗菌L-25（Brevibacillus brevis）的特異性引物Bre-F：AGACCGGGATAACATAGGGAAACTTAT， Bre-R：GGCATGCTGATCCGCG ATTACTA GC[16]。在熒光定 量PCR儀（StepOne Plus Real-time PCR System,ABI）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，記錄每個樣品的Ct值，并將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品模板的初始基因拷貝數(shù)，最終換算出每克干土的茄科勞爾氏菌或短短芽孢桿菌的基因拷貝數(shù)。

L-25與L-9分別二次發(fā)酵的生物有機(jī)肥以1:1（w:w）混合后制成的生物有機(jī)肥稱為BOF。

表1 拮抗菌二次發(fā)酵前后微生物數(shù)量 （cfu·g-1）

1.3 田間試驗(yàn)處理

2009和2010年田間試驗(yàn)均在安徽省宣城市黃渡鄉(xiāng)柏枧村中洪組進(jìn)行，試驗(yàn)田前作煙草青枯病發(fā)病率接近60%，試驗(yàn)設(shè)置兩個處理，每處理四個區(qū)組，每區(qū)組120株煙株。對照處理ACK只施用煙草專用復(fù)合肥 975 kg·hm-2（N:P2O5:K2O=10:15:25），BOF 處 理ABOF在施用817.5 kg·hm-2煙草專用復(fù)合肥基礎(chǔ)上加施375 kg hm-2的BOF，兩處理氮磷鉀量相同，磷鉀不足部分用過磷酸鈣和硫酸鉀補(bǔ)齊。試驗(yàn)田土壤理化指標(biāo)：有機(jī)質(zhì) 24.2 g·kg-1，全氮 1.32 g·kg-1，堿解氮143 g·kg-1，速效磷 10.17 g·kg-1，有效鉀 95. 2 g·kg-1，土壤pH 6.8。田間管理按照當(dāng)?shù)責(zé)熖锷a(chǎn)實(shí)施。

1.4 田間試驗(yàn)病害調(diào)查及煙株相關(guān)性狀測量

1.4.1 田間試驗(yàn)病害調(diào)查

分別在煙草移栽后50天和105天按YC/T 40-1996調(diào)查青枯病發(fā)病率及病情指數(shù)。

1.4.2 煙草產(chǎn)量測定

煙草移栽后約60-70天，葉片開始自下而上逐漸成熟，根據(jù)煙葉成熟情況由下至上分次采收并放于烤房中烘烤，烘烤后計(jì)算其產(chǎn)量。

1.4.3 酶活的測定分析

于移栽后50天和105天分別采集試驗(yàn)區(qū)煙葉、煙根及土壤樣品；對于煙葉和煙株根系樣品采用愈創(chuàng)木酚測定法測定過氧化物酶（POD）[17]；過氧化氫紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）[18]；氮藍(lán)四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）[19]；鄰苯二酚法測定多酚氧化酶（PPO）[20]；對于土壤樣品采用分光光度法測定過氧化氫酶（CAT），鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶（PPO），修改后的鄰苯三酚比色法測定過氧化物酶（POD）[21-22]。苯酚鈉比色法測定脲酶（Urease）活性[22]。

1.4.4 煙株內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察

在揚(yáng)州大學(xué)分析測試中心周衛(wèi)東老師協(xié)助下，分別對田間試驗(yàn)中健康煙株、發(fā)病煙株和生物有機(jī)肥處理中未發(fā)病煙株進(jìn)行莖部和根部的掃描電鏡（SEM）觀測。對發(fā)病煙株和健康煙株的莖基部進(jìn)行X射線能量色散譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統(tǒng)計(jì)軟件 (SPSS, IL,Chicago, USA)進(jìn)行, LSD、Duncan 新復(fù)極差進(jìn)行多重比較（P≤0.05）。

2 結(jié)果

2.1 青枯病的防控效果和產(chǎn)量

安徽試驗(yàn)點(diǎn)兩年試驗(yàn)結(jié)果表明：與對照相比，施用生物有機(jī)肥后煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著降低（圖1）。第1年和第2年CK處理移栽50天后的發(fā)病率分別為26.1%和23.9%，病情指數(shù)分別為17.4和18.2，兩年間都無顯著差異。而 BOF處理第1年和第2年的發(fā)病率分別為6.9%和1.0%，病情指數(shù)分別為3.0和0.7，兩年間存在顯著差異。同一處理第2年的發(fā)病率和病情指數(shù)都顯著低于第1年。第1年的防控效果達(dá)到75.2%，而第2年防控效果達(dá)到95.4%，比第1年高14.6%。各處理105天的發(fā)病率和病情指數(shù)均高于50天，BOF處理50天對煙草青枯病的防控效果好于105天，說明生物有機(jī)肥具有延緩發(fā)病時間和前期減輕發(fā)病的作用。

兩年田間試驗(yàn)都表明：施用混合生物有機(jī)肥后可以顯著地增加煙葉的產(chǎn)量。BOF處理與CK處理相比，第1年增產(chǎn)2.4倍，第2年增產(chǎn)2.6倍，CK處理兩年間產(chǎn)量無顯著差異，BOF處理第2年產(chǎn)量顯著高于第1年產(chǎn)量，比第1年增加11.9%。

圖1 大田試驗(yàn)小區(qū)產(chǎn)量和105天防控效果

2.2 煙株抗性酶活性

從表2、表3可以看出：對照與BOF處理相比，葉片和根系的抗性酶過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和多酚氧化酶（PPO）活性都隨發(fā)病率增高而變大，即與對照相比，施入生物有機(jī)肥后葉片和根系的抗性酶活都顯著降低了（p≤0.05）。其中，葉片的POD、CAT和SOD與發(fā)病率呈顯著相關(guān)（p≤0.05），根系CAT和PPO與發(fā)病率呈顯著相關(guān)（p≤0.05），SOD與發(fā)病率呈極顯著相關(guān)（p≤0.01）。

表2 田間試驗(yàn)植株抗性酶活性（50天）

由于在移栽后105天時煙株的中下部煙葉已經(jīng)開始落黃，煙草的生長也進(jìn)入衰退期，葉片和根系活力都大大下降（表3），葉片和根系酶活都小于移栽后50天測得的葉片和根系酶活。105天時對照處理和生

物有機(jī)肥處理間各酶活差異也小于50天，但仍呈現(xiàn)出生物有機(jī)肥處理各種抗性酶活性都顯著小于對照處理的特征。根系SOD和PPO與發(fā)病率呈顯著相關(guān)性（p≤0.05）。

表3 田間試驗(yàn)植株抗性酶活性（105天）

2.3 土壤酶活性

對照與施加生物有機(jī)肥處理50天的土壤過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶以及脲酶活性都高于105天（表4）。從兩個測定時間都可以看出，與對照處理相比，施用生物有機(jī)肥后過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶和脲酶活性都顯著增強(qiáng)。移栽后50天和105天土壤除多酚氧化酶與發(fā)病率無顯著相關(guān)性，其它各類氧化還原酶活及脲酶與發(fā)病率都呈顯著負(fù)相關(guān)性。

表4 田間試驗(yàn)土壤酶活性

2.4 煙株維管束變化

煙株生理系統(tǒng)對施入拮抗菌或發(fā)病時的響應(yīng)不只是表現(xiàn)在葉片和根抗性酶的變化，還體現(xiàn)在植物體內(nèi)維管束的變化。在掃描電鏡下，健康煙株的維管束呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)圓柱形，且導(dǎo)管通暢，管中無異物（圖2 A，D）。而被青枯病病原菌侵染發(fā)病的煙株，維管束變形導(dǎo)致畸形，維管束導(dǎo)管中間有粘液狀的物質(zhì)，堵塞了大部分維管束（圖2 B，E）。而在BOF處理中未發(fā)病的煙株，在掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)，一小部分的維管束導(dǎo)管中有粘液狀的物質(zhì)，維管束較對照稍有變形，不再是圓柱形，但與發(fā)病煙株相比，粘液狀物質(zhì)較少，大部分導(dǎo)管未被堵塞，導(dǎo)管變形不嚴(yán)重（圖2 C，F(xiàn)）。

圖2 掃描電鏡下煙草莖基部的維管束

從維管束組織的能譜圖中可以看出（圖3），健康植株中氧和碳的量最高，另外鉀、磷和鈣也有相對較小量的存在。而對照小區(qū)的病株中鉀和鈣的含量相對較高，氧和碳含量與對照較為相似。最為不同的是，在BOF處理未發(fā)病煙株中的鉀和鈣的含量相對較高，甚至鉀、鈣及磷的含量高過氧和碳。

圖3 對不同處理下木質(zhì)部組織及使維管束變形的未知物質(zhì)進(jìn)行能譜分析

3 討論

近年來研究表明，將有機(jī)肥與功能微生物（生防菌、促生菌等）相結(jié)合制成微生物有機(jī)肥后施用，對各種土傳病害具有較好的防控效果[23-25]。生物有機(jī)肥在防控香蕉枯萎病[26-27]，黃瓜枯萎病[28-29]，甜瓜枯萎病[9]，西瓜枯萎病[30]，棉花黃萎病[31]，煙草黑脛病[32]等都有成功的報(bào)道。生物有機(jī)肥的使用不但提高了土壤中有機(jī)質(zhì)含量從而促進(jìn)土壤有益微生物的生長繁殖，抑制病原菌數(shù)量[33-34]，并且促進(jìn)作物系統(tǒng)獲得抗病性(SAR)，提高自身免疫能力并促進(jìn)作物生長，有效地防控田間的病害。

植物防御酶與植物抗性關(guān)系密切[35]，它的誘導(dǎo)產(chǎn)生是植物重要的生理生化抗性機(jī)制之一，因此，植物防御酶與病害發(fā)病率間存在著一定的相關(guān)關(guān)系[36]。Goldstein等[37]證明，在田間施用堆肥和堆肥發(fā)酵液可以激活植物的許多抗病基因。植株受到拮抗菌的影響產(chǎn)生自體抗性還表現(xiàn)在系統(tǒng)抗性酶的變化上。一般情況下，當(dāng)植株受到損傷、病原菌侵染或是溫度脅迫等，植物抗性酶活就會升高[38]。吳洪生等[39]發(fā)現(xiàn)植株葉片的抗性酶與植物對病原菌侵染的響應(yīng)間有著顯著的相關(guān)性，施用BOF后可以有效增加西瓜植株抗性酶活，從而提高對病原菌的免疫抗性，發(fā)病率相應(yīng)減少。羅佳等[40]研究表明，育苗和移栽后都加入生物有機(jī)肥后，棉花黃萎病防治率大大增高，植株體內(nèi)的過氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶的活性都比對照增加了。本試驗(yàn)中通過測定煙株旺長期和成熟期內(nèi)葉片、根系及土壤各種抗性酶的變化反映煙株對病原菌做出的響應(yīng)。生物有機(jī)肥處理的葉片和根系抗性酶活都顯著小于對照處理，此結(jié)果與肖相政等[41]關(guān)于番茄施用生物有機(jī)肥后葉片的PPO和POD緩慢增加的結(jié)論相反。而在Zhao et al.[9]的研究中，施用生物有機(jī)肥后，甜瓜葉片的POD和SOD的活性都比對照降低，與本文結(jié)果相同，這可能由于BOF對煙株和病原菌產(chǎn)生的雙重作用導(dǎo)致：BOF一方面可以向煙株提供營養(yǎng)，增強(qiáng)煙株的抗逆性和免疫能力，減少煙株因受到侵害而作出的系統(tǒng)抗性反應(yīng)；另一方面BOF中的拮抗菌可以較好地抑制病原菌的數(shù)量，減少由外界損傷而對煙株造成的誘導(dǎo)效應(yīng)。

土壤的過氧化氫酶和過氧化物酶廣泛存在于土壤和生物體內(nèi)，能有效防止土壤代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物對生物體造成的毒害，其活性與土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動相關(guān)，在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過程的強(qiáng)度，可以表征土壤總的生物學(xué)活性和肥力狀況[42]，而多酚氧化酶的活性，與土壤腐殖化程度是呈負(fù)相關(guān)[22]。脲酶是一種酰胺酶，能酶促有機(jī)物質(zhì)分子中肽鍵的水解，它能專性水解尿素。已經(jīng)有研究證明，土壤的脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)[43]。人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況[22]。本試驗(yàn)中生物有機(jī)肥處理土壤的三種抗性酶活和脲酶活性都顯著高于對照，表明施用生物有機(jī)肥后土壤的生物活性和腐殖化程度增強(qiáng)，土壤氮營養(yǎng)水平增強(qiáng)，土壤趨向健康方向發(fā)展。

有相關(guān)報(bào)道表明，青枯病的主要發(fā)病機(jī)制就是菌體從植物根莖的傷口和次生根的根冠部位侵入，繼而穿過根冠和主根表皮形成的鞘，同時引起相鄰的薄壁組織的細(xì)胞壁膨脹。青枯菌侵入皮層后在細(xì)胞間隙繁殖，然后再侵入鄰近的皮層細(xì)胞。侵入植物體的青枯菌先破壞細(xì)胞間的中膠層，使寄主植物的細(xì)胞壁解體，質(zhì)壁分離，細(xì)胞器變形，形成空腔。青枯菌還可以從植物的受傷部位侵入，直接進(jìn)入導(dǎo)管繁殖。青枯菌在導(dǎo)管生長時可以產(chǎn)生大量胞外多糖，胞外多糖影響和阻礙植物體內(nèi)的水分運(yùn)輸，特別是易于對葉柄結(jié)和小葉處較小孔徑的導(dǎo)管穿孔板造成堵塞，因而引起植株萎蔫。同時，青枯菌還向細(xì)胞外分泌多種細(xì)胞壁降解酶（例如果膠酶和纖維素酶），這些細(xì)胞壁降解酶可能也在破壞導(dǎo)管組織引起植株枯萎死亡方面有重要作用[44,45]。用掃描電鏡結(jié)合能譜儀分析技術(shù)能夠較準(zhǔn)確地觀測并分析出植物組織超微結(jié)構(gòu)的變化特征及各種元素在植物體內(nèi)的含量、分布、存在狀態(tài)和其對植物生長發(fā)育造成的生理生化改變等[46]。目前已經(jīng)有研究表明，當(dāng)烤煙受到煙草花葉病毒侵染后葉片中超微結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生變化，葉綠體結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，被膜及類囊體膜破壞，基質(zhì)外流，基本上未見到有完整被膜的葉綠體及其內(nèi)的基粒結(jié)構(gòu)[12]。李海燕等[47]研究表明，在根莖性病害辣椒疫霉菌作用下，辣椒葉片組織的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。玉米受到莖腐病影響，玉米根細(xì)胞壁被降解，玉米胚根細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)也被損傷[48]。本文通過對植株的根部和葉片進(jìn)行掃描電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)，被茄科勞爾氏菌侵染的煙株導(dǎo)管中布滿粘性物質(zhì)，堵塞維管束，可能影響水分的運(yùn)輸，從而引起煙株青枯病的發(fā)生。而且導(dǎo)管嚴(yán)重變形，而健康對照煙株的導(dǎo)管束生長正常。從能譜圖中可以看出，被病原菌侵染的煙株中的K和Ca含量較高，這可能是由于植物抗病性在病原菌侵染條件下受到刺激而變化，Liu et al.[49]的研究也得到類似結(jié)果，同時劉淑欣等[50]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，葉片中隨著磷鉀養(yǎng)分含量的增加，葡萄植株抗性增強(qiáng)，葉片發(fā)病率顯著減小，這與本試驗(yàn)中的生物有機(jī)肥處理維管束中的P、K含量升高結(jié)果一致。

4 結(jié)論

抑制煙草青枯病生物有機(jī)肥的施用可以誘導(dǎo)并促進(jìn)煙草在土傳病害環(huán)境脅迫下產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，也可以促進(jìn)土壤生物活性的提高，一定程度減少煙草維管束變形和木質(zhì)部堵塞情況的發(fā)生，進(jìn)而達(dá)到對煙草青枯病的有效防控。

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