高玉龍，肖炳光，Ralph E Dewey

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南省玉溪市南祥路14號 653100;

2 北卡州立大學(xué) Raleigh, NC 27695-7620

植物開花是一個(gè)復(fù)雜過程，受外部環(huán)境因素和內(nèi)部基因表達(dá)的影響調(diào)控。擬南芥的開花受光周期、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑控制[1]，光周期途徑信號經(jīng)CO(CONSTANCE)傳遞給FT（Flowering Locus T），春化途徑和自主途徑信號經(jīng)FLC（Flowering Locus C）傳遞給FT，F(xiàn)T基因的表達(dá)誘導(dǎo)花分生組織特異基因AP1(APETALA1)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)開花。可見，F(xiàn)T基因是控制植物開花信號的匯集點(diǎn)。從對擬南芥FT基因的研究來看，F(xiàn)T編碼的蛋白可能是植物“開花素”的重要組成部分[2-4]。FT基因在誘導(dǎo)植物早花的基因工程研究中應(yīng)用也最為廣泛和有效。

FT基因編碼的蛋白質(zhì)屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP）家族，不同作物的FT基因高度保守。通過異位表達(dá)擬南芥FT基因，能夠誘導(dǎo)番茄[5]、矮牽牛[6]、瓜類蔬菜[7]等提前開花。

利用FT基因誘導(dǎo)早花在煙草中也已有報(bào)道，Ramsey等[8]將擬南芥FT基因?qū)氚桌邿烼N90中組成型表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株播種后40天左右開花，而正常的非轉(zhuǎn)基因植株要145天左右開花。Ramsey提出將轉(zhuǎn)FT基因應(yīng)用于煙草回交育種，與常規(guī)回交選育相比，育成新品種的時(shí)間可以縮短將近一半，利用病毒表達(dá)載體使FT基因在煙草中瞬時(shí)表達(dá)，能夠誘導(dǎo)短日照馬里蘭煙在長日照條件下開花[9-10]。

我國煙草育種工作雖然取得了明顯的成績，但目前生產(chǎn)上的主栽品種比較單一，急需加大煙草品種選育的力度和進(jìn)度，而煙草生育期比較長，是限制煙草育種進(jìn)程的一個(gè)主要因素。PVX表達(dá)系統(tǒng)能夠快速表達(dá)外源基因，而且不涉及轉(zhuǎn)基因。本研究利用PVX瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)使擬南芥FT基因在烤煙、香料煙、白肋煙中瞬時(shí)表達(dá)，建立誘導(dǎo)煙草早花的PVX-FT系統(tǒng)，以期為加快煙草育種進(jìn)程提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種K326，云煙87，紅花大金元；白肋煙品種TN90；香料煙TEVB(轉(zhuǎn)基因Xanthi，將TEV的HC-Pro基因?qū)隭anthi，使PVX病毒更容易侵染)。

限制性內(nèi)切酶購于NEB，T4 DNA連接酶購于大連寶生物。根癌農(nóng)桿菌GV3101，PVX-FT病毒表達(dá)載體由北卡州里大學(xué)Ralph Dewey教授惠贈(zèng)。

1.2 農(nóng)桿菌滲濾

將構(gòu)建的載體pCAM:pGR106-FT和空載體pCAM:pGR106質(zhì)粒DNA通過凍融法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌種GV3101。選取4片真葉左右煙苗的底部2片真葉滲濾法分別接種，利用3mL注射器吸取滲濾液，注射器對著葉片背面輕輕擠壓，直到整個(gè)葉面濕潤。具體步驟參考Van der Hoorn等[11]。

1.3 煙苗生長條件及調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

煙苗種植于光照培養(yǎng)室，光照12 h白天，黑夜12 h。溫度設(shè)定為白天26℃，黑夜18℃。PVX癥狀出現(xiàn)時(shí)間、現(xiàn)蕾和開花時(shí)間分別以50%試驗(yàn)苗出現(xiàn)PVX癥狀、現(xiàn)蕾和開花的時(shí)間表示。

1.4 FT基因表達(dá)分析

取滲濾后不同時(shí)間段有PVX病毒癥狀的煙株葉片，用Trizol（Invitrogen）提取RNA，SuperScript II RT（Invitogen）合成cDNA。對FT基因的表達(dá)進(jìn)行半定量PCR（RT-PCR）分析。

2 結(jié)果

2.1 PVX-FT系統(tǒng)在不同煙草類型中的效果

PVX-FT系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)供試烤煙、香料煙、白肋煙品種早花。PVX病毒癥狀在接菌后7～14天出現(xiàn)，質(zhì)粒pCAM:pGR106對照要比pCAM:pGR106-FT處理提前2～3天出現(xiàn)PVX癥狀。接菌后23～35天pCAM:pGR106-FT處理處于現(xiàn)蕾期，接菌后39～50天pCAM:pGR106-FT處理開花（表1）。質(zhì)粒對照和buffer對照在pCAM:pGR106-FT處理開花時(shí)仍然處于營養(yǎng)生長階段（圖1）。

表1 參試品種各階段的觀察記載

圖1 PVX-FT系統(tǒng)誘導(dǎo)不同類型煙草早花

2.2 PVX-FT系統(tǒng)滲濾后FT基因的表達(dá)分析

為了研究滲濾后FT基因在煙株中的表達(dá)情況，我們提取了接菌后4天，8天，12天，現(xiàn)蕾階段，開花階段葉片的RNA，進(jìn)行FT基因的RT-PCR。在試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)同一批滲濾煙株（TEVB），少量植株接菌后表現(xiàn)病毒癥狀，但不早花。提取這些植株的兩個(gè)時(shí)間段（與表現(xiàn)早花植株現(xiàn)蕾和開花同時(shí)間）葉片RNA，進(jìn)行RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)不早花的植株，F(xiàn)T基因不表達(dá)。早花植株在接菌后4天到開花期都能檢測到FT基因的表達(dá)（圖2）。

圖2 滲濾后TEVB葉片中FT基因的RT-PCR分析

3 討論

馬鈴薯X病毒作為瞬時(shí)表達(dá)載體具有宿主范圍廣泛、轉(zhuǎn)化方法簡單、可快速得到高拷貝的外源基因、目的基因不需穩(wěn)定整合到宿主基因組中就可以系統(tǒng)侵染植株等優(yōu)點(diǎn)，而且其不能通過昆蟲介體傳播，因而成為理想的植物病毒表達(dá)載體之一。1992年Chapman等[12]成功構(gòu)建PVX表達(dá)載體，目前，已被廣泛應(yīng)用于研究病毒的侵染、移動(dòng)、病毒蛋白的功能及生產(chǎn)外源蛋白[13-14]等方面。但是，PVX表達(dá)載體也有一些缺陷。如其對外源基因大小有一定的限制，PVX載體對于超過2kb的基因很難表達(dá)或不表達(dá)；PVX載體經(jīng)多代繁殖后外源基因容易丟失等。

植物每個(gè)調(diào)控途徑有一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及多個(gè)基因。由于FT基因參與了多個(gè)開花調(diào)控途徑，并且其位于開花通道下游，所以FT基因被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)植物早花研究。利用蘋果潛隱球形病毒（ALSV）在大豆中使擬南芥FT基因瞬時(shí)表達(dá)，F(xiàn)TALSV能使短日照大豆在長日照條件下，在第四到第七節(jié)（侵染后40天左右）期開花，而對照要到20節(jié)以上才開花[15]。不僅如此，F(xiàn)T基因還能誘導(dǎo)多年生的蘋果樹早花，利用ALSV載體使擬南芥FT基因在蘋果樹中瞬時(shí)表達(dá)，在侵染后45到60天，蘋果樹就能開花，大大縮短了蘋果育種中每代需要的時(shí)間[16]。Li等[9]利用PVX載體在馬里蘭煙中瞬時(shí)表達(dá)FT，誘導(dǎo)短日照習(xí)性的馬里蘭煙在長日照條件下早花。本研究利用PVX病毒載體將擬南芥FT基因在不同類型煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果表明PVX-FT系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)烤煙、白肋煙和香料煙早花。可見PVX-FT系統(tǒng)可以誘導(dǎo)不同類型煙草早花。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)PVX-FT處理一批苗時(shí)會有個(gè)別煙株不表現(xiàn)早花的現(xiàn)象，這種煙株中檢測不到FT基因表達(dá)，這種現(xiàn)象可能是由于PVX-FT載體在繁殖過程中FT基因丟失造成的。本研究構(gòu)建的PVX-FT系統(tǒng)，可明顯縮短煙草每世代所需的時(shí)間，應(yīng)用于煙草常規(guī)育種后將大大縮短育成新品種所需的時(shí)間。由于PVX-FT侵染煙草后會植株會表現(xiàn)PVX癥狀，所以該技術(shù)適用于不對性狀進(jìn)行選擇的情況下，如育種加代或利用與某個(gè)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記對性狀進(jìn)行選擇時(shí)。

4 結(jié)論

利用PVX病毒瞬時(shí)表達(dá)載體使擬南芥FT基因在煙草中瞬時(shí)表達(dá)，該技術(shù)能夠誘導(dǎo)烤煙、白肋煙和香料煙早花。將該技術(shù)應(yīng)用于煙草育種，可以縮短每個(gè)世代所需的時(shí)間，從而加快育成新品種的時(shí)間。

[1]Martinez-Zapater J M, Coupland G, Dean C, et al. The transition to flowering in Arabidopsis [M]// Meyerowitz E M, Somerville C R. Arabidopsis . Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1994:403-434.

[2]Kardailsky I, Shukla V K, Ahn J H, et al. Activation tagging of the fl oral inducer FT[J]. Sci, 1999, 286: 1962-1965.

[3]Kobayashi Y, Kaya H, Goto K, et al. A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals[J].Sci, 1999, 286: 1960-1962.

[4]Corbesier L, Vincent C, Jang S, et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in fl oral induction of Arabidopsis [J]. Sci, 2007.316: 1030-1033.

[5]Lifschitz E，Eshed Y. Universal fl origenic signals triggered by FT homologues regulate growth and fl owering cycles in perennial day-neutral tomato [J]. J Exp Bot, 2006, 57:3405-3414.

[6]Hayama R, Agashe B, Luley E, et al. A circadian rhythm set by dusk determines the expression of FT homologs and the short-day photoperiodic fl owering response in Pharbitis[J].Plant Cell, 2007, 19:2988-3000.

[7]Lin M K, Belanger H, Lee Y J, et al. FLOWERING LOCUS T protein may act as the long-distance fl origenic signal in the Cucurbits[J].Plant Cell, 2007, 19:1488-1506.

[8]Ramsey S L, Kernodle S P. A method for accelerated trait conversion in plant breeding [J].Theor Apple Genet, 2009,118:1499-1508.

[9]Li C, Zhang K, Zeng X,et al. A cis element within Flowering Locus T mRNA determines its mobility and facilitates traf fi cking of heterologous viral RNA[J]. J Virol,2009, 83, 3540-3548.

[10]Li C, Gu M, Shi N, et al. Mobile FT mRNA contributes to the systemic florigen signalling in floral induction[J]. Sci Rep, 2011,1: 73.

[11]Van der Hoorn R A, Laurent F,Roth R, et al. Agroin fi ltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis[J].MOL PLANT MICROBE IN, 2000,13 (4): 439-46.

[12]Chapman S, Kavanagh T, Baulcombe D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants[J].Plant J, 1992, 2:549-557.

[13]Hendy S, Chen Z C, Barker H, et al. Rapid production of single-chain Fv fragments in plants using a potato virus X episomal vector [J]. J Immunol Methods, 1999, 231: 137-146.

[14]Marusic C, Rizza P, Lattanzi L,et al. Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunode fi ciency virus type 1[J]. J Virol, 2001, 75: 8434-8439.

[15]Yamagishi N, Sasaki S, Yamagata K. Promotion of flowering and reduction of a generation time in apple seedlings by ectopical expression of the Arabidopsis thaliana FT gene using the Apple latent spherical virus vector[J]. Plant Mol Biol, 2011, 75: 193-204.

[16]Yamagishi N，Yoshikawa N. Expression of FLOWERING LOCUS T from Arabidopsis thaliana induces precocious flowering in soybean irrespective of maturity group and stem growth habit[J]. Planta, 2011, 233:561-568.