韓富根，康雪莉，王利超，李飛，李麗華，王涵

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國家栽培生理生化研究基地，鄭州 450002

為了有效減輕害蟲為害造成的經(jīng)濟(jì)損失，長期以來生產(chǎn)上主要依賴化學(xué)合成殺蟲劑控制作物害蟲，同時(shí)亦減弱了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的自然控制力量——害蟲天敵的作用[1]，某些非選擇性化學(xué)殺蟲劑還具有刺激害蟲生殖的效應(yīng)，導(dǎo)致一些害蟲的再猖獗[2]。使用化學(xué)殺蟲劑對(duì)于作物來說也是一種逆境脅迫，對(duì)作物的生長生理及產(chǎn)量品質(zhì)具有諸多負(fù)面效應(yīng)[3]，并且污染環(huán)境，危及生態(tài)安全。植物性殺蟲劑源于植物次生代謝物質(zhì)，因其具有良好環(huán)境相容性而日益受到重視[4]。目前化學(xué)殺蟲劑在烤煙上的研究則多偏重于圍繞合理設(shè)置經(jīng)濟(jì)閾值，制定害蟲防治指標(biāo)，改善化學(xué)合成殺蟲劑的劑型和使用方法，延緩害蟲的抗藥性，提高對(duì)害蟲的防治效果，減少煙葉農(nóng)藥殘留等方面[5-6]。有關(guān)化學(xué)殺蟲劑脅迫下烤煙的生理響應(yīng)方面的研究尚未見報(bào)道。植物性殺蟲劑在烤煙上的研究也僅停留在對(duì)害蟲的防治效果上[7]。碳氮代謝是烤煙最基本的生理代謝過程，與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)[8]。為此，筆者在大田條件下，就煙葉生長過程中的碳氮代謝關(guān)鍵酶和保護(hù)酶對(duì)施用殺蟲劑的響應(yīng)進(jìn)行了研究，分析了化學(xué)合成農(nóng)藥和植物性殺蟲劑對(duì)烤后煙葉內(nèi)在品質(zhì)的影響，為合理使用殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)于2009年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)正常施肥煙田進(jìn)行，煙苗采用漂浮育苗, 于5月5日移栽,行距1.1 m, 株距0.55 m, 田間管理按優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)栽培規(guī)范進(jìn)行。

小區(qū)設(shè)以下4個(gè)處理，CK: 噴施清水；T1：噴施化學(xué)殺蟲劑；T2：噴施植物性殺蟲劑1號(hào)；T3：噴施植物性殺蟲劑2號(hào)。團(tuán)棵期噴施第一次，現(xiàn)蕾時(shí)（打頂?shù)?天，即移栽后70天）噴施第2次，常用化學(xué)殺蟲劑為10%吡蟲啉，有效成分18 g/hm2（河南遠(yuǎn)見農(nóng)業(yè)科技有限公司）、植物性殺蟲劑均稀釋500倍液，全株噴霧，以葉面葉背濕透但不滴液為度。植物殺蟲劑1號(hào)和2號(hào)均為本課題組研制的對(duì)煙青蟲和煙蚜有較好控制效果的專利配方（主要為煙葉、苦參等植物提取組合物）。在每次噴施前都認(rèn)真清洗器械，以防交叉影響。

分別于移栽后36 d（團(tuán)棵期）、移栽后69 d(打頂當(dāng)天）噴施殺蟲劑，并于移栽后37 d、53 d、69 d、83 d測定單株葉面積，于移栽后37 d、53 d、69 d、71 d、77 d取中部定位葉（依測定時(shí)煙株的葉數(shù)而定），用于酶活性的測定。煙葉成熟時(shí)按小區(qū)采收，并用小型電熱烤箱按照三段式烘烤工藝進(jìn)行調(diào)制。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

單株葉面積按照國家煙草專賣局煙草農(nóng)藝性狀的調(diào)查方法進(jìn)行測定[9]。取鮮煙葉測定酶活性，硝酸還原酶活性采用活體法[10]，轉(zhuǎn)化酶活性采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[10]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法[11]，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[11]，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[11]。

各小區(qū)烤后煙葉按烤煙42級(jí)(國標(biāo))分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，并取中部橘黃三級(jí)(C3F)煙葉用于化學(xué)成分[12]和致香物質(zhì)含量檢測。

中性致香物質(zhì)的提取和定性定量：致香物質(zhì)含量采用 HP5890II一5972 氣質(zhì)聯(lián)用儀( Agilent 公司)。在同時(shí)蒸餾萃取裝置的一端接盛有10 g 煙樣、1 g 檸檬酸、350 mL 蒸餾水和0.5 mL 內(nèi)標(biāo)的500 mL 圓底燒瓶，使用恒溫電熱套進(jìn)行加熱；裝置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷的250 mL 圓底燒瓶，該端燒瓶置于水浴溫度為 60℃ 的恒溫鍋中加熱，同時(shí)蒸餾萃取 2.5 h 后加入10 g 無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，然后于 60℃ 水浴中濃縮至1 mL 左右。分析樣品由GC／MS鑒定結(jié)果和NIST庫檢索定性。GC／MS分析條件：色譜柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：He；流速：0.8 mL／min；進(jìn)樣口溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：177℃；升溫程序：初溫50℃，恒溫2 min 后，以 2℃／min的速度升至120℃，5 min后以 2℃／min 的速度升至 240℃，保持30 min；分流比1:15；進(jìn)樣量2ul ；電離能70 eV；質(zhì)量數(shù)范圍25-500 amu；MS譜庫NIST02；采用硝基苯內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的方差分析采用SPSS17.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物性殺蟲劑對(duì)烤煙全株葉面積的影響

從表1可以看出，全株葉面積移栽后37 d，T2顯著高于T1，二者均顯著高于對(duì)照和T3；移栽后53 d，T2和T3均顯著高于T1，這3個(gè)處理均顯著低于對(duì)照；移栽后69 d，T1和T3均顯著低于對(duì)照；移栽后83 d，T3顯著高于T1，這2個(gè)處理均顯著低于對(duì)照。由此表明，噴施殺蟲劑煙株前期（移栽后37 d到53 d)煙葉生長緩慢，尤其化學(xué)殺蟲劑較慢，移栽后53 d到69 d期間，化學(xué)殺蟲劑（T1）的煙葉生長明顯加快，移栽后69 d到83 d對(duì)照和處理煙葉生長均較為穩(wěn)定。

表1 殺蟲劑對(duì)烤煙單株葉面積及生長速率的影響

2.2 植物性殺蟲劑對(duì)煙葉碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.2.1 對(duì)煙葉硝酸還原酶（NR）活性的影響

硝酸還原酶(NR)是高等植物氮素同化的限速酶，其活性反映了植物氮代謝的強(qiáng)度，并直接影響著煙株氮素的同化利用[12-13]。從圖1可以看出，煙葉NR活性對(duì)照和處理總體變化態(tài)勢基本一致，均隨著噴施殺蟲劑后時(shí)間的推移呈先升高，當(dāng)煙株打頂時(shí)（移栽后69 d)達(dá)到峰值（T2則為移栽后71 d) 而后下降的趨勢，煙葉NR活性在各測定時(shí)間（移栽后77 d T2略高于對(duì)照除外）處理均低于對(duì)照，不同處理比較，移栽后53d T1＞T2＞T3,其余各測定時(shí)間內(nèi)均是 T2＞T3＞T1。

圖1 殺蟲劑對(duì)NR活性的影響

2.2.2 對(duì)煙葉轉(zhuǎn)化酶（Inv)活性的影響

運(yùn)轉(zhuǎn)，減少葉綠體中淀粉積累量，使光合碳固定加強(qiáng)[14]。煙葉Inv活性對(duì)照和處理隨著移栽后時(shí)間的推移，均呈M型變化態(tài)勢（圖2）；不同處理比較，移栽后69 d T2＞T1＞T3，移栽后77 d和移栽后83 d均是 T2＞T3＞T1，其余各測定時(shí)間均是 T3＞T2＞T1。由此導(dǎo)致全生育期平均煙葉Inv活性T1、T2和T3分別比對(duì)照降低22.05%、6.64%和6.84%。

圖2 殺蟲劑對(duì)Inv活性的影響

轉(zhuǎn)化酶（Inv)與碳代謝密切相關(guān)，可催化細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化形成單糖，從而促進(jìn)葉綠體內(nèi)磷酸丙糖向外

2.3 植物性殺蟲劑對(duì)煙葉保護(hù)酶及丙二醛的影響

由表2可知，移栽后53 d（煙株旺長期）煙葉CAT活性處理均高于對(duì)照，以T2較高，T3次之，T1較低；移栽后77 d（煙株圓頂期）煙葉CAT活性T2與對(duì)照差異不明顯，T1顯著高于T3，均顯著高于對(duì)照，而煙葉SOD活性則均是處理高于對(duì)照。由此表明，噴施殺蟲劑協(xié)同增強(qiáng)了煙葉SOD和CAT活性，從而使其煙葉MDA含量不過多積累。

表2 殺蟲劑對(duì)烤煙保護(hù)酶的影響

2.4 植物性殺蟲劑對(duì)烤煙化學(xué)成分的影響

由表3可看出，噴施殺蟲劑后總氮、煙堿、還原糖和氯都有所降低，總糖、鉀含量有所提高。主要含氮化合物與碳水化合物含量的變化導(dǎo)致了其比值的變化。一般認(rèn)為：優(yōu)質(zhì)煙化學(xué)成分品質(zhì)指標(biāo)水溶性糖與煙堿的比值接近于10，總氮與煙堿的比值接近于1為佳[15]。從這兩者比值來看，噴施殺蟲劑的處理均與優(yōu)質(zhì)煙葉化學(xué)成分指標(biāo)較為接近，其中植物性殺蟲劑煙葉鉀素含量較高，尤其植物性殺蟲劑1號(hào)鉀素提高幅度較大。可見噴施植物性殺蟲劑1號(hào)煙葉化學(xué)成分更趨于協(xié)調(diào)。

表3 殺蟲劑對(duì)烤煙化學(xué)成分的影響

2.5 植物性殺蟲劑對(duì)烤煙致香成分的影響

經(jīng)GC／MS對(duì)烤后煙葉樣品的中性香氣成分進(jìn)行定性定量分析，共檢出28種對(duì)煙氣香味品質(zhì)影響較大的致香物質(zhì)（見表4）。不同處理比較，CK煙葉中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和氧化異佛爾酮2種致香物質(zhì)含量較高，T1煙葉中脫氫β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮2、糠醛、5-甲基糠醛、2-乙?；量┖捅揭掖?種致香物質(zhì)含量較高，T3煙葉中6-甲基-5-庚烯-2-酮、巨豆三烯酮3、巨豆三烯酮4、3-羥基-β-二氫大馬酮、螺巖蘭草酮、糠醇、2-乙酰呋喃、苯乙醛和茄酮9種致香物質(zhì)含量較高，T2煙葉中其余11種致香物質(zhì)均較高。煙葉中新植二烯及其以外致香物質(zhì)含量和致香物質(zhì)總量以T2較高，T3次之，T1煙葉新植二烯以外致香物質(zhì)含量較高于對(duì)照，但其新植二烯含量較對(duì)照降低較多。因而對(duì)照煙葉致香物質(zhì)總量高于T1。

3 討論

大部分化學(xué)農(nóng)藥對(duì)作物生長會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。冬性植物油菜春化階段外施15mol/L馬拉硫磷推遲油菜抽苔和花芽分化[16]，施用1.0～2.5kg/hm2（有效劑量）氟樂靈大豆出苗后根瘤酶形成及其固氮活動(dòng)均受到不同程度的抑制[17]，有的甚至有利于作物的生長[18-19]。本研究結(jié)果表明，煙株圓頂后（移栽后83d)全株葉面積化學(xué)殺蟲劑處理比對(duì)照減少10.89%，植物性殺蟲劑1號(hào)和2號(hào)分別比對(duì)照減少3.66%和7.28%。這說明煙田噴施殺蟲劑總體上對(duì)煙葉生長產(chǎn)生了一定的不利影響，其中植物性殺蟲劑1號(hào)的不利影響較小。比較而言，化學(xué)殺蟲劑處理煙株前期煙葉的生長相對(duì)緩慢。這可能與煙株不同時(shí)期煙葉的幼嫩程度對(duì)不同殺蟲劑反應(yīng)的差異有關(guān)。

碳氮代謝是植物最基本的代謝，NR和Inv是植物碳氮代謝過程中的關(guān)鍵酶。目前煙葉NR和Inv對(duì)不同條件響應(yīng)的研究較多[20-22]，而有關(guān)煙葉NR和Inv對(duì)噴施殺蟲劑相應(yīng)的研究甚少。本研究結(jié)果顯示，噴施殺蟲劑總體上降低了全生育期的煙葉NR和Inv活性，其中植物性殺蟲劑1號(hào)和2號(hào)均較化學(xué)殺蟲劑的這種降低作用弱，尤其1號(hào)較2號(hào)相對(duì)更弱。

從噴施殺蟲劑后各測定時(shí)間煙葉NR和Inv活性的關(guān)系來看（圖1和圖2），在同一測定時(shí)間噴施殺蟲劑的同一個(gè)處理煙葉NR活性較對(duì)照降幅較大時(shí)，煙株自身同時(shí)調(diào)節(jié)其煙葉Inv活性較對(duì)照的降幅不至于過低，同樣當(dāng)同一時(shí)間噴施殺蟲劑的同一個(gè)處理煙葉NR活性較對(duì)照的降幅小時(shí)，煙株自身同時(shí)調(diào)節(jié)其煙葉Inv活性較對(duì)照的降幅增大。從煙葉碳氮代謝相關(guān)成分來看，殺蟲劑處理煙葉主要碳氮化學(xué)成分尤其植物性殺蟲劑1號(hào)更趨于協(xié)調(diào)，鉀素含量也相對(duì)較高。這暗示噴施殺蟲劑存在有少許傷害有益的超補(bǔ)償現(xiàn)象[23]。

SOD和CAT是植物體內(nèi)的保護(hù)酶，SOD主要是清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，CAT主要位于線粒體內(nèi)，在葉片中具有分解光呼吸時(shí)產(chǎn)生的過氧化氫，過氧化氫積累過多，會(huì)降低CO2的同化效率；MDA是植物細(xì)胞膜過氧化的最終產(chǎn)物，可與細(xì)胞內(nèi)的各種成分發(fā)生反應(yīng)，使多種酶和膜系統(tǒng)遭受損傷。本研究結(jié)果表明，殺蟲劑脅迫引起了煙葉的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)了煙葉SOD和CAT酶活性，從而使煙葉MDA含量維持在相對(duì)較低的水平，使煙葉細(xì)胞免受其傷害，對(duì)維持煙葉生理功能具有一定作用。這可能是殺蟲劑脅迫下，煙葉得以正常生長發(fā)育，主要碳氮化學(xué)成分趨于協(xié)調(diào)的微觀生理原因。

表4 殺蟲劑對(duì)烤煙致香物質(zhì)含量的影響 （μg/g）

已有的研究結(jié)果表明，煙葉碳氮代謝的平衡協(xié)調(diào)程度直接或間接影響煙葉化學(xué)成分的含量和組成比例[8]，這在本研究中也得到了證實(shí)。然而有關(guān)碳氮代謝與致香物質(zhì)形成關(guān)系的研究還較為缺乏。 本研究檢測到的28種煙葉主要香氣成分中，對(duì)照和各處理烤后煙葉新植二烯的含量均占絕對(duì)優(yōu)勢，一般認(rèn)為新植二烯是在調(diào)制過程中由葉綠素降解形成的葉綠素醇脫水產(chǎn)生的[24]，化學(xué)殺蟲劑煙葉新植二烯含量較對(duì)照低可能是由其對(duì)煙株較深程度的脅迫影響到葉綠素的合成。噴施植物性殺蟲劑煙葉新植二烯含量比對(duì)照和化學(xué)殺蟲劑要高，這可能是植物性殺蟲劑處理促進(jìn)了煙株對(duì)氮素的吸收和轉(zhuǎn)化，形成較多葉綠素有關(guān)，也可能是植物性殺蟲劑處理煙株碳氮代謝平衡得到了優(yōu)化的同時(shí)，緩解了煙株對(duì)氮素和鉀素吸收的拮抗作用，促進(jìn)了煙株對(duì)鉀素的吸收利用有關(guān)，鉀素含量的提高（表3），有利于葉綠素和致香物質(zhì)的形成，還可能是植物性殺蟲劑處理煙株碳氮代謝協(xié)調(diào)程度較好，改善了煙葉烘烤特性，有利于煙葉葉綠素的降解有關(guān)，或者是這些因素綜合作用的結(jié)果。由此導(dǎo)致了植物性殺蟲劑1號(hào)和2號(hào)處理的煙葉新植二烯及其以外致香物質(zhì)含量和致香物質(zhì)總量均較高，尤其1號(hào)相對(duì)更高。

4 結(jié)論

相對(duì)于10%吡蟲啉和植物性殺蟲劑2號(hào)，植物性殺蟲劑1號(hào)處理全株葉面積、煙葉NR和Inv活性總體上降幅較小，煙株前期（移栽后53d)煙葉脂膜過氧化水平較低，烤后煙葉主要化學(xué)成分更趨于協(xié)調(diào)，致香物質(zhì)總量增幅較高，是較優(yōu)的選擇。

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