劉美榮 肖瑞飛 左和寧

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

腸易激綜合征（irritabel bowel snydrom，IBS）是一種以腹痛或腹部不適和排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯穆怨δ苄阅c病，腦腸軸的變化和影響在IBS的發(fā)病中起重要作用，而腦腸肽作為一類具有神經(jīng)遞質(zhì)和激素雙重功能的小分子多肽，在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺、分泌和運(yùn)動(dòng)中起重要作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺IBS-D模型大鼠足三里、太沖穴，能抑制回腸SS、VIP、P物質(zhì)的分泌[1]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上采用慢性溫和應(yīng)激聯(lián)合孤養(yǎng)法加灌服番瀉葉刺激大鼠造成IBS-D模型，通過觀察針刺足三里、太沖穴對(duì)IBS-D大鼠腹瀉指數(shù)及血液和回腸、直腸組織中VIP和NPY表達(dá)的影響，以期為臨床上使用該針刺療法治療IBS-D提供充分的科學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠50只，雌雄各半，體重200～250g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（SCXK 2009-004）。

1.2 藥物 匹維溴銨，50mg/片（solvay pharma公司，批號(hào)：611243）。番瀉葉，購(gòu)于湖南省藥材公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科鑒定為真品。

1.3 試劑與儀器 96T VIP、NPY酶聯(lián)免疫試劑盒（上海滬峰生物科技有限公司）；分析天平（AY120）；低溫離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；低溫冰箱（日本三洋）；三用電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；安迪牌無(wú)菌針灸針，0.25mm×25mm（貴州安迪藥械有限公司，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB2024-94）；大鼠固定板（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸實(shí)驗(yàn)室提供）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組 將大鼠隨機(jī)分為空白組和造模組（1∶4），除空白組外，各組均予濃度為2g/mL的番瀉葉水煎劑灌胃。灌胃0.5h后，用慢性溫和束縛應(yīng)激加孤養(yǎng)法刺激大鼠。每日隨機(jī)對(duì)大鼠做以下1項(xiàng)處理，前后2d的處理不同：（1）用漆包線捆綁住大鼠的雙后肢，使之不能正?；顒?dòng)，造成一定應(yīng)激刺激， 每次持續(xù) 2h；（2） 夾尾 1min；（3）45℃高溫環(huán)境5min；（4）4℃冰水游泳 3min；（5）晝夜顛倒；（6）禁食 24h；（7）電熱恒溫振蕩水槽水平振蕩（160次/min）45min。共刺激14d。[2]模型評(píng)價(jià)：檢測(cè)腹瀉指數(shù)，造模組與空白組比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義證明模型成功。用Excel隨機(jī)函數(shù)“Rand”將造模組隨機(jī)意義模型組、捆綁組、針刺組、藥物組，每組10只，單籠喂養(yǎng)。

2.2 藥物制備及給藥劑量 匹維溴銨片，研磨后用蒸餾水溶解，按大鼠與成人體表面積換算配制成濃度為0.3mg/mL的溶液，灌胃給藥，給藥體積10mL/kg。

2.3 針刺方法 造模結(jié)束后，空白組、模型組、捆綁組和針刺組灌胃生理鹽水，藥物組灌服匹維溴銨溶液。針刺組給予針刺相應(yīng)穴位，捆綁組在與針刺組同等條件和相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予同樣的捆綁刺激。針刺組每日施針1次，連續(xù)14d。穴位定位依據(jù)：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用腧穴簡(jiǎn)表”定位[3]。“足三里”穴：后肢關(guān)節(jié)下腓骨頭內(nèi)側(cè)5mm處；“太沖”穴：后肢足背第 1、第2趾骨間凹陷處。直刺5mm。捻轉(zhuǎn)針法：固定大鼠四肢和頭尾，將腧穴按常規(guī)皮膚消毒，施針者以左手食指或拇指切按準(zhǔn)穴位，右手持針垂直刺入穴位內(nèi)。得氣后，用均勻的指力施捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉手法?！白闳铩毖ㄐ心磙D(zhuǎn)補(bǔ)法：向心角度捻轉(zhuǎn)，幅度 90°左右，頻率 120次/min?！疤珱_”穴行捻轉(zhuǎn)瀉法：離心角度捻轉(zhuǎn)，幅度 180°左右，頻率60次/min。每穴操作 3min，留針30min。

2.4 觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.4.1 腹瀉指數(shù)測(cè)定 分別在造模前1d、治療前1d、治療后14d依照文獻(xiàn)[4]方法測(cè)定5h內(nèi)各組大鼠腹瀉指數(shù)。

2.4.2 VIP和NPY的測(cè)定 在治療第14d后，各組大鼠禁食但不禁水16h，腹腔注射0.3mL/100g新配制的10%水合氯醛。麻醉后腹主動(dòng)脈插EDTA管采血，將分離出的血漿置于冰箱中-20℃保存?zhèn)溆?。采血后，取大鼠回盲部以上約5cm處一小段回腸組織及肛門以上約2cm處一小段直腸組織，立即生理鹽水沖洗干凈，無(wú)菌濾紙吸干后精密稱重，充分勻漿后低溫離心，將分離出的上清液置于冰箱中-20℃保存?zhèn)溆?。VIP和NPY的含量嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件分析處理，計(jì)量資料以（）表示，符合正態(tài)和方差齊性者，組內(nèi)前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析q檢驗(yàn)，P＜0.05即認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01則認(rèn)為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn)，如數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后仍不滿足方差分析條件，則采用秩和檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 腹瀉指數(shù)的比較 造模前各組大鼠均無(wú)腹瀉，腹瀉指數(shù)為0。造模后模型組、捆綁組、針刺組、藥物組腹瀉指數(shù)明顯升高，與空白組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。治療后捆綁組與模型組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；針刺組、藥物組腹瀉指數(shù)明顯降低，與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；針刺組與藥物組比較無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 大鼠血漿、回腸組織、直腸組織中VIP和NPY含量比較與空白組比較，模型組大鼠血漿、回腸組織中VIP含量顯著升高，NPY 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；直腸組織中NPY含量顯著降低（P＜0.05）。治療后捆綁組與模型組相比較各指標(biāo)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與模型組比較，針刺組、藥物組血漿、回腸組織中VIP含量顯著降低，NPY含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；直腸組織中 NPY 含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

4 討論

IBS在中醫(yī)學(xué)中屬 “泄瀉”、“腹痛”范疇。中醫(yī)認(rèn)為七情失調(diào)可引起內(nèi)臟功能發(fā)生紊亂，尤其對(duì)肝脾有很大的影響。肝郁脾虛是IBS發(fā)病的病理基礎(chǔ)，《醫(yī)方考》所云：“瀉責(zé)之脾，痛責(zé)之肝，肝責(zé)之實(shí)，脾責(zé)之虛，脾虛肝實(shí)，故會(huì)痛瀉?！币虼烁斡羝⑻撌荌BS最為多見的證型。針灸治療IBS的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)副作用，可避免因胃腸疾病而對(duì)藥物吸收造成影響，減少消化道的負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)研究比前期研究中增加了捆綁組，更客觀地消除了捆綁過程對(duì)針刺的影響[1]。

IBS的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為是一種動(dòng)力異常性疾病。但近年研究表明，感染、應(yīng)激及神經(jīng)免疫內(nèi)分泌機(jī)制在IBS的發(fā)病中占有重要地位。胃腸肽類激素不僅作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，而且也參與IBS發(fā)病的神經(jīng)免疫機(jī)制[5]。VIP作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可抑制小腸環(huán)形括約肌的收縮，同時(shí)刺激膽汁和小腸水電解質(zhì)的分泌。Ho等[6]發(fā)現(xiàn)，腸神經(jīng)叢中約46%的u-阿片樣受體具有VIP的免疫活性，同時(shí)有68%的腸神經(jīng)叢VIP受體具有阿片樣活性，表明VIP可能通過兩種受體途徑發(fā)揮其對(duì)腸道的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠血漿和回腸組織中VIP水平顯著高于空白組；而直腸組織中VIP水平與空白組比較無(wú)顯著性差異，提示VIP可能在不同環(huán)節(jié)參與IBS的發(fā)病。NPY是由36個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道交感神經(jīng)叢，可引起血管收縮，其含量與應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)。腸神經(jīng)叢中NPY可與腸黏膜下神經(jīng)節(jié)中的周圍性膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶相結(jié)合，從而發(fā)揮作用[7]。

本研究結(jié)果顯示，模型組腸黏膜NPY含量明顯低于空白組。此結(jié)果與國(guó)外一些學(xué)者的研究結(jié)果相同，這可能提示NPY不足，不能發(fā)揮其抑制性作用，從而使模型組大鼠的消化道分泌反應(yīng)提高，腹瀉形成[8-9]。另外，本研究結(jié)果顯示模型組大鼠血漿中NPY含量也明顯低于空白組，此結(jié)果與 Magnus S等學(xué)者[10-11]的研究結(jié)果一致。通過治療，針刺組和藥物組大鼠血漿及腸組織中NPY含量明顯升高。故認(rèn)為NPY含量降低在IBS發(fā)病中有一定作用。

本實(shí)驗(yàn)僅選取有代表性的兩種腦腸肽研究其與IBS的關(guān)系，今后應(yīng)擴(kuò)展腦腸肽的研究種類，并選取更廣泛的標(biāo)本，以進(jìn)行較為全面細(xì)致深入的研究，為臨床針刺治療IBS-D提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 造模前、造模后、治療后各組大鼠腹瀉指數(shù)比較（）

表1 造模前、造模后、治療后各組大鼠腹瀉指數(shù)比較（）

注：與同時(shí)期空白組比較，**P＜0.01；與同時(shí)期模型組比較，▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 造模前 造模后 治療后空白組100.00±0.000.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 0.00±0.00 1.07±0.13** 0.89±0.21捆綁組 10 0.00±0.00 1.08±0.15** 0.95±0.19針刺組 10 0.00±0.00 1.06±0.11** 0.18±0.17▲▲藥物組 10 0.00±0.00 1.07±0.12** 0.17±0.20▲▲

表2 治療后各組大鼠血漿、回腸組織、直腸組織中腦腸肽含量比較（）

表2 治療后各組大鼠血漿、回腸組織、直腸組織中腦腸肽含量比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）空白組 10血漿VIP（ng/L） NPY（ng/L） VIP（ng/g）95.819±2.775 83.374±1.751 73.047±2.342回腸組織NPY（ng/g）77.263±0.847直腸組織VIP（ng/g） NPY（ng/g）193.781±4.757 156.776±2.899模型組 10捆綁組 10 117.113±3.437 70.571±1.380 96.508±2.073 60.645±1.344 183.722±6.688132.662±3.509針刺組 10 96.812±3.197▲ 81.447±1.517▲ 74.039±2.337▲▲ 71.892±1.327▲ 178.056±3.583 153.334±2.185▲藥物組 10 96.081±2.973▲ 81.010±1.739▲ 75.682±2.249▲▲ 71.724±0.984▲ 193.648±4.875 152.500±1.805▲115.074±4.168*70.109±1.287* 95.611±2.154**60.152±1.183**189.668±4.931 132.286±2.345*

[1]劉美榮，肖瑞飛，彭芝配，等.針刺“足三里”“太沖”穴對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠胃腸激素的影響.針刺研究，2012，37（5）：363

[2]樊江波，暢洪昇，董世芬.慢性應(yīng)激致腸易激綜合征大鼠模型的建立與評(píng)價(jià).中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2010，18（2）：91

[3]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué).北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：327

[4]周干南，胡芝華，汪亞先.小鼠腹瀉模型的制備與腹瀉指數(shù)的應(yīng)用.中草藥，1994，25（4）：195

[5]袁耀宗.腸易激綜合征.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2002：29

[6]Ho A，Lievore A，Patierno S，et al.Neurochemically distinct classes of myenteric neurons express the muopioid receptor in the guinea pig ileum.J Comp Neurol，2003，458：404

[7]Chiocchetti R，Poole DP，Kimura H，et a1.Evidence that two form s of choline acetyl transferase are differentially expressed in subclasses of enteric neurons.Cell Tissue Res，2003，311（1）：11

[8]Magnus S，Per-Ove S，Henrik S，et al.Abnormal levels of neuropeptide Y and peptide YY in the colon in irritable bowel syndrome.Europem Journal of Gastroenterology &Hepatology，2003，15（1）：55

[9]Holzer-Petsche U，Petritsch W，Hinterleitner T，et al.Effect of neuropeptide Y on jejunal water and ion transport in humans.1991，101：325

[10]Simren M，Jarbur K，Bjomsson E，et al.Coordination between intestinal motility and secretion in patients with diarrheaprome and constipation-prone irritable bowel syndrome（IBS）.Gastroenterology，2001，120：713

[11]Gui XY.Mast cells：possible link between psychiligical stress，enteric infection，food allergy and gut hypersensitivity in the irritable bowel syndrome.J Gastroenterol Hepatol，1998，13：980