大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的建立及鑒定*

范 悅，商亞珍

(河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細(xì)胞，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞有星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多，幾乎囊括了所有膠質(zhì)細(xì)胞的功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互作用，以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)神經(jīng)元的生存、正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理發(fā)育及病理過(guò)程都具有重要作用[1-2]。本研究探討了如何建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可行的獲得高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，以期為星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM-F12培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司;胎牛血清，奧地利PAA公司;胰蛋白酶，華美生物工程有限公司;纖維酸性蛋白(GFAP)一抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;羊抗兔二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生1-3d的SD大鼠，雌雄不限。剪開(kāi)皮膚和顱骨，取兩塊皮質(zhì)，預(yù)冷PBS漂洗1-2次后，仔細(xì)剝除腦膜和血管。剪碎，加入0.125%胰蛋白酶置于37℃培養(yǎng)箱中消化30min,消化完全后加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。3500r/min離心5min，棄上清，計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/ml的密度接種于用0.1%多聚賴氨酸鋪底的培養(yǎng)瓶中。30min后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細(xì)胞懸液，重新接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，差速貼壁以除去成纖維細(xì)胞。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3d換液一次。

1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)至10-12d，待細(xì)胞80-90%融合時(shí)傳代。加入適量0.1%胰蛋白酶(以剛剛覆蓋細(xì)胞層為宜)后立即于倒置顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞突起縮回、變圓時(shí)，立即吸出培養(yǎng)液，加入少量含10%胎牛血清的培養(yǎng)液直接吹打，待細(xì)胞層脫落。計(jì)數(shù)，以密度2×105個(gè)/ml接種于0.1%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，當(dāng)7-8d細(xì)胞80-90%融合時(shí)，再次傳代。

1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 培養(yǎng)第3代的細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板內(nèi)事先用0.1%多聚賴氨酸包被的圓形蓋玻片上，培養(yǎng)48h后進(jìn)行免疫組化染色。吸去24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS漂洗2-3次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min后行免疫組化染色，一抗稀釋度1:100，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，GFAP陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞漿。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 剛接種的細(xì)胞為圓形，胞體較小，3-6h貼壁。3-4d可見(jiàn)細(xì)胞基本呈圓形，長(zhǎng)出細(xì)小突起。5-7d細(xì)胞突起變長(zhǎng)，呈梭形、多邊形等形狀。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量增多，胞體變大，逐漸交織成網(wǎng)狀。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，3-4h貼壁，2-3d呈多種形態(tài)，6-7d細(xì)胞80-90%融合。在培養(yǎng)過(guò)程中可偶見(jiàn)神經(jīng)元，但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和傳代逐漸消失。

2.2 免疫組化結(jié)果 GFAP陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒狀。細(xì)胞分兩層，上層為纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞核小，突起長(zhǎng)而細(xì);下層為原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞核大，橢圓，形狀不規(guī)則。隨機(jī)選取若干視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，顯示細(xì)胞純度95%以上。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要間質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成神經(jīng)組織網(wǎng)架，具有分裂能力，可分泌和釋放多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，形成神經(jīng)元微環(huán)境，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能[3]。

體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，并非來(lái)自已經(jīng)完全分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，而是它們的前體細(xì)胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中經(jīng)發(fā)育、分化，最終成為成熟的膠質(zhì)細(xì)胞。因此，取材時(shí)間最好在出生后的早期，此時(shí)前體細(xì)胞的數(shù)量接近峰值[4]。另外，使用新生1-3d大鼠的原因是出生后神經(jīng)元不再分裂，可盡量減少神經(jīng)元的污染，且神經(jīng)元不能傳代，經(jīng)過(guò)數(shù)次傳代即可去除神經(jīng)元。而星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖發(fā)生在胚胎晚期和出生后，生長(zhǎng)旺盛[5]。而且1-3d新生大鼠腦膜和血管較好剝離，盡量剝除腦膜和血管可以減少成纖維細(xì)胞的污染[6]。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的為混合星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞分為上下兩層，纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞和原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞都屬于星形膠質(zhì)細(xì)胞，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求不同，將兩種細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)[7]。原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞多分布于腦和脊髓的灰質(zhì)，含膠原纖維少，細(xì)胞體較大，突起寬而扁，分支少;纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞多分布于腦和脊髓的白質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)富含膠原纖維，突起細(xì)長(zhǎng)，分支多[8]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多的一種除了以往認(rèn)識(shí)的在神經(jīng)系統(tǒng)中有營(yíng)養(yǎng)支持作用外，與神經(jīng)元之間還存在復(fù)雜的相互作用，也與許多神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，尤其是神經(jīng)炎癥反應(yīng)，由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)。膠質(zhì)細(xì)胞的異常改變直接影響神經(jīng)功能的正常發(fā)揮[9-10]。因此，建立星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法有利于探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中的角色，以及研究藥物的作用及機(jī)制。

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