王利利（綜述），夏金榮（審校）

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院消化科，江蘇南京210009）

·綜 述·

肝纖維化分子水平研究新進(jìn)展

王利利（綜述），夏金榮*（審校）

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院消化科，江蘇南京210009）

肝硬化；分子生物學(xué)；綜述文獻(xiàn)

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是機(jī)體對(duì)各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)和各種慢性肝病向肝硬化（liver chirosis，LC）發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑。HF的形成過程受到眾多因子的調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced

glycation end products，AGEs）及其受體等，它們之間相互影響。本文就HF發(fā)病的分子水平研究新進(jìn)展綜述如下。

1 TGF-β/Smad

TGF-β主要由肝臟中的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）、成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFs）、庫普弗細(xì)胞等產(chǎn)生，在哺乳動(dòng)物有3種亞型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1在HF發(fā)生發(fā)展中有重要作用，是重要的致纖維化因子，可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的表型及功能，誘導(dǎo)其分化轉(zhuǎn)移，同時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的合成，調(diào)節(jié)其形成、降解和免疫應(yīng)答等［1］。TGF-β與其受體結(jié)合，可誘導(dǎo)下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括Smad蛋白、細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。其激活Smad蛋白并形成復(fù)合物后，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。

Smad蛋白家族是TGF-β1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要蛋白，包括受體依賴性Smad蛋白（Smad1/ Smad2/Smad3/Smad5/Smad8）、介質(zhì)性Smad蛋白（Smad4）和抑制性Smad蛋白（Smad6/Smad7）等。

不同的Smad蛋白介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)傳導(dǎo)。Smad2、Smad3作為TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游信號(hào)因子，能激活HSCs導(dǎo)致HF的發(fā)生。靜止的HSCs主要表達(dá)Smad2，活化的HSCs主要表達(dá)Smad3。Smad3蛋白在調(diào)節(jié)MFs的增殖、誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達(dá)、參與Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ，ColⅠ）合成和分泌等方面有重要作用。TGF-β/ Smad可以通過與其他信號(hào)通路相互作用來加強(qiáng)或抑制Smad3的磷酸化，其中MAPK途徑是一個(gè)重要的途徑，包括ERK、Jun氨基末端激酶和p38。Smad7是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制分子，可與Smad2或Smad3競爭性地結(jié)合TGF-β1型受體或Smad4，阻斷Smad2或Smad3被磷酸化及轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)［2］。有研究［3］證明β2血影蛋白在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖中扮演了重要角色，而p13/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Ser/Thr protein kinase，Akt）通過與Smad蛋白和β2血影蛋白互動(dòng)，參與了TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

2 NF-κB

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括5個(gè)亞單位，Rel、p65、RelB、p50和p52。在哺乳動(dòng)物中，NF-κB是由p65和p50組成的異源二聚體。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，p65亞基與抑制蛋白（inhibitory kappa B，IκB）單體結(jié)合，覆蓋p50的核定位信號(hào)，從而使NF-κB與IκB以三聚體失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素1、脂多糖等多種因素刺激后，IκB發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從NF-κB三聚體上解離，使p50的核定位信號(hào)暴露，繼而使NF-κB激活并移入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)TNF-α、白細(xì)胞介素1、細(xì)胞間黏附分子1等基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致TNF-α、白細(xì)胞介素1等因子大量表達(dá)，從而引發(fā)一系列反應(yīng)，促進(jìn)HSCs的激活，最終促進(jìn)HF，NF-κB p65亞基的活化也許是HF重要的調(diào)節(jié)因子［4］。NF-κB在非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制中起一定作用，NF-κB1基因敲除的非酒精性脂肪性肝炎大鼠，4周后，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平增高，肝細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、膠原蛋白沉積、HSCs激活均增加，Col I等的mRNA表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)γ干擾素表達(dá)也有所增加［5］。

3 AGEs

AGEs是蛋白質(zhì)非酶糖基化和氧化終末產(chǎn)物，通過非受體及受體兩大主要途徑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。AGEs有多種受體，其中最重要的是晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）。RAGE是AGEs的一種特征性細(xì)胞表面受體，為免疫球蛋白超家族成員，由400多個(gè)氨基酸組成。RAGE廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，活化后可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)蛋白激酶和核因子的活性，與HF、糖尿病、慢性腎病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病均密切相關(guān)［6］。細(xì)胞表面的RAGE與AGEs等配體相互作用后，可使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激、活性氧簇產(chǎn)生增加，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB等的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因表達(dá)，最終導(dǎo)致HF［7］。Goodwin等［8］研究發(fā)現(xiàn)，AGEs能促進(jìn)HSCs的增殖和活化，在膽總管結(jié)扎的大鼠中AGEs牛血清白蛋白可以通過增加膠原和α平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)而顯著增加HF程度，表明AGEs對(duì)慢性肝損傷及HF的發(fā)生發(fā)展有重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明AGEs通過激活NF-κB和下調(diào)胰島素樣生長因子1受體，可以促進(jìn)血管平滑肌的鈣化［9］。研究［10］證實(shí)，RAGE基因特異性siRNA能在HSC-T6內(nèi)抑制RAGE、α平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA和蛋白質(zhì)

水平表達(dá)的活性。提示RAGE在HSCs激活和膠原形成中發(fā)揮著重要的作用。

4 CTGF

CTGF是一種由349個(gè)氨基酸組成的富含半胱氨酸的分泌肽，可直接使原代HSCs活化、增殖及遷移，并能促進(jìn)活化的HSCs合成及分泌ECM，使ColⅠ、ColⅢ顯著增加。

CTGF通過激活Ras/Raf/ERK等信號(hào)通路促進(jìn)MFs增殖，通過前膠原A2基因上的應(yīng)答元件刺激ColⅠ、ColⅢ合成，參與ECM的產(chǎn)生、積聚，促進(jìn)纖維化的進(jìn)展。在CTGF啟動(dòng)子序列166和244核苷酸位點(diǎn)之間存在著TGF-β對(duì)CTGF的誘導(dǎo)所必須的功能性Smad的結(jié)合位點(diǎn)，CTGF的產(chǎn)生與MAPK和Smad信號(hào)調(diào)節(jié)通路相關(guān)。在丙型肝炎病毒感染的樣本中，CTGF顯著增多，CTGF的產(chǎn)生與MAPK和Smad信號(hào)調(diào)節(jié)通路相關(guān)，敲除CTGF調(diào)節(jié)基因的siRNA，可減少丙型肝炎病毒感染細(xì)胞中致纖維化因子的表達(dá)［11］。CTGF是TGF-β1的下游高效反應(yīng)元件，TGF-β1通過調(diào)控CTGF啟動(dòng)子內(nèi)TGF-β1反應(yīng)元件和Smad結(jié)合元件誘導(dǎo)CTGF的產(chǎn)生。CTGF是TGF-β1誘導(dǎo)大鼠HSCs等合成ECM的下游介導(dǎo)者，提示CTGF是纖維化信號(hào)通路下游的共同效應(yīng)分子［12］。

5 血小板衍生生長因子（p latelet-derived grow th factor，PDGF）

PDGF包括PDGFⅠ及PDGFⅡ，具有3種二聚體結(jié)構(gòu)，PDGF-AA、PDGF-BB及PDGF-AB。PDGF是HSCs的強(qiáng)效致分裂劑，對(duì)HSCs的激活、增殖等均有明顯的促進(jìn)作用。PDGF可刺激HSCs轉(zhuǎn)化為MFs，促進(jìn)其產(chǎn)生ColⅠ及ColⅢ。PDGF與受體結(jié)合后，使受體自動(dòng)磷酸化，激活一系列下游信號(hào)途徑，其中黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）-磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt-核糖體蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)是調(diào)節(jié)HSCs增殖的重要途徑。PDGF和TGF-β是2個(gè)主要致纖維化因子，二氫硫辛酸可以抑制PDGF/TGF-β對(duì)HSC-T6的刺激作用和ROS的產(chǎn)生，此過程可以通過MAPK和PI3K/Akt信號(hào)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)［13］。PDGF可通過上調(diào)TGF-β的表達(dá)促進(jìn)HSCs的激活，并與TGF-β構(gòu)成活化HSCs的自分泌循環(huán)，使HSCs持續(xù)激活。PDGF有2種受體PDGFα和PDGFβ，前者在靜止的HSCs中表達(dá)，后者在MFs中表達(dá)，PDGFβmRNA的表達(dá)與肝臟膠原含量相關(guān)，顯性抑制PDGFβ受體的腺病毒可改善HF的進(jìn)展，提示阻斷PDGFβ受體信號(hào)通路在治療HF中有一定的作用［14］。

6 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix m etalloproteinases，MMPs）

MMPs家族有26個(gè)成員，編號(hào)分別為MMP1～26，目前分為6類，即膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、弗林蛋白酶活化的MMP和其他分泌型MMP。MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，尤其是ColⅠ、ColⅢ。MMPs的活性與基質(zhì)金屬組織蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）相關(guān)。TIMP是MMPs的抑制物，能抑制MMPs的活性，從而使ECM降解減少而導(dǎo)致HF的發(fā)生。ROS可通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)和調(diào)控HSCs中MMP-2的表達(dá)［15］。MMP-2缺失的大鼠，其HF程度較正常對(duì)照組增加2倍，ColⅠmRNA的表達(dá)增加3倍，提示MMP-2能抑制活化的HSCs表達(dá)ColⅠ，抑制HF的發(fā)展［16］。

7 脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）

ADP是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)。ADP能維持HSCs的靜息狀態(tài)，抑制PDGF誘導(dǎo)的HSCs的遷移與增殖，減少TGF-β的表達(dá)。ADP也可通過抑制Smad2從而抑制HSCs合成TGF-β1及CTGF。大鼠HSCs可表達(dá)ADP-R1和ADP-R2。外源性全長ADP可抑制原代HSCs的增殖，增加MMP-13基因及蛋白水平的表達(dá)，從而影響HF的發(fā)展［17］。ADP通過抑制NF-κB活化，減少TNF-α刺激引起的血管細(xì)胞黏附分子1、白細(xì)胞介素8在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，通過激活環(huán)磷腺苷依賴的蛋白激酶A（cyclic-AMP dependent protein kinase A，PKA）信號(hào)通路，調(diào)節(jié)對(duì)NF-κB的抑制作用。ADP還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而減輕系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［18］。

8 其 他

γ干擾素能抑制HSCs的增殖和活化，下調(diào)ECM的合成，顯著抑制內(nèi)皮素前體1 mRNA的表達(dá)和內(nèi)皮素1肽的產(chǎn)生，這些作用與激活蛋白1和Smad3通路有關(guān)［19］。血管緊張素Ⅱ能刺激機(jī)體活化的HSCs增殖和膠原的合成，其致纖維化反應(yīng)受其Ⅰ型受體調(diào)節(jié)，并且與p38MAPK的磷酸化作用、氧化合物誘導(dǎo)的ROS及TGF-β1的表達(dá)相關(guān)［20］。

重組人成骨蛋白7可減少HSCs中Ⅰ型及Ⅲ型膠原的分泌，其可能通過阻止HSCs及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Smad2/3在細(xì)胞核內(nèi)的積累或抑制TGF-β1的過量表達(dá)，從而減輕HF［21］。內(nèi)皮素可使Smad1/5/8活性明顯增高，促進(jìn)ERK1/2磷酸化，并使α平滑肌肌動(dòng)蛋白、CTGF水平上調(diào)［22］。胱抑素C對(duì)半胱氨酸蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，與ECM成分的代謝及LC的發(fā)生有著密切的關(guān)系?？紤]胱抑素C是通過抑制組織蛋白酶的活性，影響MMP和TIMP之間的平衡，從而參與細(xì)胞外膠原蛋白的形成過程［23］。肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）可以通過降解累積的膠原蛋白、減少纖維化相關(guān)基因的表達(dá)等多種機(jī)制改善HF。在HGF誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖的過程中，纖溶酶含量有所增加，纖維標(biāo)志物纖溶酶原激活物抑制劑1、TGF-β1和TIMP-2的基因表達(dá)有所減少。在纖溶酶活化的肝纖維化模型中，HGF增加了凝血酶敏感蛋白1蛋白分解，抑制TGF-β1活化、降低ColⅠ的表達(dá)；當(dāng)纖溶酶被相應(yīng)的抑制酶阻斷時(shí)，HGF無法減少TGF-β1、ColⅠ的表達(dá)。考慮HGF可能通過刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶，對(duì)抗TGF-β1依賴的凝血酶敏感蛋白1的活化，減少TGF-β1的相關(guān)纖維標(biāo)志物的活化，從而減輕HF［24］。

綜上所述，HF的發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果，在受到各種因素刺激后，體內(nèi)各種細(xì)胞因子的合成和分泌發(fā)生變化，各細(xì)胞因子間相互影響，最終導(dǎo)致了HF。不同的細(xì)胞因子之間相互協(xié)同和拮抗，調(diào)節(jié)HF的進(jìn)展。目前，雖然對(duì)HF的發(fā)病機(jī)制研究很多，但HF的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究有助于尋找HF治療的新靶點(diǎn)和新途徑。

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（本文編輯：趙麗潔）

R657.31

A

1007-3205（2013）07-0856-05

2013-04-16；

2013-06-30

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2009284）

王利利（1988-），女，江蘇宿遷人，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事消化科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.045