■吳逸飛 孫 宏 姚曉紅 湯江武 王 新柳 永 李園成

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430010)

微生態(tài)制劑又稱為益生素，是在微生態(tài)理論指導(dǎo)下采用有益微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥等工藝制成的生物制劑或活菌制劑，它是養(yǎng)殖業(yè)中抗生素有效的替代品。目前，作為微生態(tài)制劑使用的微生物主要包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌3類。其中芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑，具有抗逆性好、耐高溫、易儲(chǔ)存等特點(diǎn)，較其它兩者具有較大優(yōu)勢(shì)。隨著2006年起歐盟國家對(duì)飼料中添加抗生素的全面禁止，微生態(tài)制劑替代抗生素的應(yīng)用逐步受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注；同時(shí)芽孢桿菌的生產(chǎn)品種和規(guī)模也日益擴(kuò)大，研究確定其在動(dòng)物腸道內(nèi)的作用機(jī)理顯得十分必要。

1 芽孢桿菌在動(dòng)物腸道內(nèi)的作用機(jī)理

芽孢是芽孢桿菌進(jìn)入動(dòng)物腸道的主要形式。芽孢能否在動(dòng)物腸道中萌發(fā)、增殖是影響其飼用效果的主要因素。

1.1 芽孢桿菌對(duì)腸道不良環(huán)境的抵抗

動(dòng)物的腸道內(nèi)存在諸多不良的環(huán)境，如低pH值的胃酸、高濃度的膽鹽、相對(duì)厭氧的環(huán)境等，這些環(huán)境不利于微生態(tài)制劑發(fā)揮作用。因此如何有效抵御這些不良環(huán)境的影響，是芽孢桿菌在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用的前提。在體外試驗(yàn)中，Hyronimus等（2000）研究了13種芽孢桿菌對(duì)腸道模擬液的耐受情況，發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）的芽孢能夠抵抗膽鹽濃度為0.3%的模擬腸胃液。相似的研究也表明枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的芽孢對(duì)腸道酸性環(huán)境的耐受性要明顯好于其營養(yǎng)體（Clavel等，2004）。同時(shí)，研究表明芽孢對(duì)于胃腸道極端環(huán)境的耐受性，隨著芽孢桿菌種類的不同而各不相同，特別是蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）所產(chǎn)芽孢的耐受性相對(duì)較差（Duc等，2004）。體內(nèi)研究表明，當(dāng)大鼠灌喂2×108CFU枯草芽孢后，幾乎所有的芽孢均可抵御胃腸道的不利環(huán)境而在小腸中發(fā)揮作用（Duc等，2003），而采用芽孢桿菌的營養(yǎng)體處理，在小腸中幾乎檢測(cè)不到營養(yǎng)體細(xì)胞。對(duì)于芽孢如何能夠在體內(nèi)抵御各種不良環(huán)境，目前還沒有定論。一種可能的原因是芽孢在經(jīng)過整個(gè)動(dòng)物消化道的過程中，可以耐受胃酸，從而順利到達(dá)腸道，在消化液稀釋作用的幫助下，最終在腸道得以順利萌發(fā)（Faille，2004）。

1.2 芽孢在動(dòng)物腸道中的萌發(fā)

芽孢桿菌以芽孢方式攝入體內(nèi)，必然和普通乳酸菌等益生菌的作用方式有差異。國外從上世紀(jì)80年代開始對(duì)芽孢在動(dòng)物腸道內(nèi)的作用方式進(jìn)行研究。Ozawa等（1981）通過給斷奶仔豬飼喂B.subtilis后，發(fā)現(xiàn)消化道中其數(shù)量不斷增加，在停止飼喂芽孢桿菌后一周，在豬的后腸仍能檢測(cè)出104～105個(gè)/g芽孢。Klijn等（1995）以105CFU嗜熱芽孢桿菌（B.stearothermophilus）芽孢喂食小鼠，8 d后糞便中仍然可持續(xù)檢測(cè)到芽孢的存在。如此長的保留時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于土壤微生物在腸道中的保留時(shí)間，表明芽孢在腸道中存在一定的互作機(jī)制。

另一方面，芽孢在不同試驗(yàn)動(dòng)物腸道中的保留特性差異很大。在禽類中的定植時(shí)間要顯著高于哺乳動(dòng)物。如La Ragion等（2003）的研究表明，B.subtilis的芽孢能在肉雞中持續(xù)存在36 d以上。Youngman等（1984）發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物投加108CFU芽孢，在攝入3 h后就可以在糞便中檢測(cè)到其存在，并發(fā)現(xiàn)糞便中總的芽孢數(shù)量為攝入量的6倍以上。因此，該試驗(yàn)結(jié)果可以間接推斷出芽孢在進(jìn)入動(dòng)物腸道后，存在一個(gè)萌發(fā)過程。隨著研究的不斷深入，已在越來越多種類的芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，包括蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等（Jadamus，2001）。目前，最為直接的證據(jù)是采用分子生物學(xué)手段對(duì)芽孢的萌發(fā)進(jìn)行研究。Casula等（2002）將枯草芽孢桿菌的ftsH基因和大腸桿菌的lacZ基因進(jìn)行融合，由于ftsH基因只在芽孢桿菌的營養(yǎng)體階段表達(dá)，因此這個(gè)融合基因的mRNA只在芽孢萌發(fā)時(shí)才能夠被檢測(cè)。通過這種分子手段，最終發(fā)現(xiàn)芽孢可能最早在空腸內(nèi)就已萌發(fā)。

1.3 芽孢桿菌在動(dòng)物腸道中抑菌作用機(jī)理

添加芽孢桿菌能夠減少腸道中有害微生物的數(shù)量，同時(shí)提高腸道益生菌的數(shù)量。Han等（1984）研究發(fā)現(xiàn)，生長豬連續(xù)飼喂5周含有丁酸梭菌的飼料，排出的糞便中腸球菌和腸桿菌的數(shù)量顯著降低，而丁酸梭菌和乳酸桿菌的數(shù)量則顯著增加。關(guān)于芽孢桿菌的抑菌機(jī)理，目前主要有生物奪氧、菌群調(diào)整、生物拮抗、提高免疫功能和增強(qiáng)酶活性，防止動(dòng)物腸道病原菌等多種說法。

芽孢桿菌為需氧菌，在生長過程中需要消耗大量的氧氣，該環(huán)境有利于乳酸菌、雙歧桿菌等厭氧菌的生長，抑制需氧腸桿菌的繁殖，從而減少消化道疾病的發(fā)生。Maruta等（1996）采用飼喂生豬含有107CFU/g B.subtilis的日糧3周后發(fā)現(xiàn)，糞便中的厭氧菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著上升，而需氧菌如腸桿菌的數(shù)量顯著下降，其它病原菌如鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量也顯著下降。

芽孢桿菌還能夠產(chǎn)生某些抑菌物質(zhì)，對(duì)一些病原菌起拮抗作用，進(jìn)而調(diào)整腸道微生態(tài)平衡。Teo等（2005）從雞腸道中分離得到一株B.subtilis PB6，發(fā)現(xiàn)其對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有明顯的拮抗作用，隨后他們又從PB6的培養(yǎng)物中分離得到大小約為960 Da到983 Da不等的拮抗因子，發(fā)現(xiàn)該拮抗因子對(duì)艱難梭菌、肺炎鏈球菌、空腸彎曲菌和彎曲菌的生長均有抑制作用。

芽孢桿菌的攝入能夠刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)，使淋巴組織處于高度反應(yīng)狀態(tài)。Scharek（2007）飼喂生豬B.subtilis，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。Duc（2004）的研究發(fā)現(xiàn)攝入機(jī)體內(nèi)的芽孢能夠分散在腸道淋巴組織周圍，推測(cè)芽孢桿菌可能的作用部位是腸道內(nèi)的淋巴系統(tǒng)。也有研究發(fā)現(xiàn)芽孢能夠刺激動(dòng)物機(jī)體的B淋巴細(xì)胞群，產(chǎn)生IgG、IgA等抗體，進(jìn)而發(fā)生一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)（Guidi-Rontani，1999）。國內(nèi)潘康成等（2005）的研究表明，芽孢的攝入能夠誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生特定的細(xì)胞因子。

2 芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

2.1 芽孢桿菌在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

芽孢桿菌能夠耐受動(dòng)物胃液，在動(dòng)物腸道中生長萌發(fā)，且分泌多種酶類，促進(jìn)動(dòng)物體消化吸收，同時(shí)在腸道內(nèi)競(jìng)爭性奪氧，形成厭氧環(huán)境，減少有害微生物含量，促進(jìn)益生菌生長，從而改善動(dòng)物腸道環(huán)境。國外La Ragione等（2003）在對(duì)禽類喂食一定量的枯草芽孢后發(fā)現(xiàn)，芽孢能夠有效的抑制致病菌大腸桿菌O78：K80和沙門氏菌，并且促進(jìn)腸道內(nèi)乳桿菌等益生菌的生長。Wang等（2009）利用復(fù)合芽孢桿菌制劑（包含枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌）分別以0.05%、0.1%和0.2%添加量添加到基礎(chǔ)日糧中飼喂生長豬35 d后，發(fā)現(xiàn)隨著芽孢添加量的提高，豬的日增重也逐漸提高，試驗(yàn)組的日均采食量顯著高于對(duì)照組，但對(duì)料重比、干物質(zhì)和氮消化利用率均沒有顯著影響。添加蠟狀芽孢桿菌能夠提高豬的料肉比，且對(duì)預(yù)防豬腸道疾病有較好的幫助（Kyriakis等，1999）。Kritas等（2006）研究了芽孢桿菌制劑對(duì)羔羊死亡率和綿羊產(chǎn)奶量的影響，發(fā)現(xiàn)添加芽孢桿菌能夠降低羔羊死亡率。陳家祥等（2010）以地衣芽孢桿菌飼喂麻羽肉雞發(fā)現(xiàn)，添加不同水平的地衣芽孢桿菌和抗生素都有增高肉雞腸絨毛高度、降低隱窩深度和增加腸黏膜厚度的作用。

2.2 芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用要廣于動(dòng)物養(yǎng)殖，特別是枯草芽孢桿菌對(duì)蝦的腸道致病菌有明顯的改良作用。這主要是因?yàn)檠挎邨U菌可以產(chǎn)生多種酶類，降解水體中的多種有機(jī)物，直接利用水體中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，從而對(duì)水體中的多種病原菌起到拮抗作用，改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)（Urdaci和Pinchuk，2004）。Saeed等（2006）通過向水體中潑灑芽孢桿菌制劑，發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦腸道中的芽孢桿菌數(shù)明顯提高，而其它細(xì)菌無明顯變化；腸道中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶顯著高于對(duì)照組，存活率比對(duì)照組顯著提高。Vaseeharan等（2003）研究認(rèn)為，枯草芽孢桿菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦黑鰓病的病原菌哈氏弧菌的生長有抑制作用，長期使用將使對(duì)蝦的累積致死率比對(duì)照組減少90%。另外芽孢桿菌還能顯著促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的消化吸收，提高營養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)的消化利用率。

3 研究與應(yīng)用展望

研究已表明芽孢桿菌可耐受動(dòng)物腸道的惡劣環(huán)境，萌發(fā)成營養(yǎng)體最終刺激腸道免疫系統(tǒng)發(fā)揮其作用。盡管如此，目前還存在很多問題尚未解決，①在不同的養(yǎng)殖動(dòng)物中，由于芽孢的萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)位置不同，具體的使用劑量有待進(jìn)一步研究完善(特別是芽孢在瘤胃動(dòng)物中的作用機(jī)制和體內(nèi)試驗(yàn)很少)；②芽孢桿菌產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)、檢測(cè)方法等行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)尚未建立；③芽孢桿菌如何影響?zhàn)B殖動(dòng)物消化器官發(fā)育，刺激動(dòng)物體機(jī)體免疫能力；④芽孢與腸道菌群互作效應(yīng)未知等。當(dāng)前，抗生素濫用、食品安全和環(huán)境保護(hù)等問題已經(jīng)成為各國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中考慮的重點(diǎn)，因此，芽孢桿菌類微生態(tài)制劑必將具有更廣闊的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。

（參考文獻(xiàn)25篇，刊略，需者可函索）