趙 卉，廖 勇，楊蓉婭

1 真菌生物膜感染的重要性

免疫缺陷狀態(tài)、廣譜抗生素的使用、手術(shù)造成黏膜屏障的破壞、放療和化療、腸外營(yíng)養(yǎng)以及留置導(dǎo)管的廣泛應(yīng)用，使得真菌已成為重要的院內(nèi)感染相關(guān)病原菌。念珠菌已成為院內(nèi)重癥監(jiān)護(hù)患者菌血癥的第三大常見(jiàn)病原菌，也是真菌相關(guān)生物膜感染的最常見(jiàn)病原菌。白念珠菌細(xì)胞黏附于留置醫(yī)療器械表面，形成生物膜結(jié)構(gòu)，并引起真菌血癥及播散性感染；這種植入物相關(guān)感染很難根治，需要通過(guò)移除植入物和長(zhǎng)期的抗真菌治療才能達(dá)到滿(mǎn)意療效。此外，光滑念珠菌，近平滑念珠菌，克柔氏念珠菌及熱帶念珠菌也可以引起導(dǎo)管相關(guān)醫(yī)源性和醫(yī)療植入物相關(guān)感染[1]。其他真菌也可以引起生物膜相關(guān)感染，包括球孢菌屬、曲霉菌屬、接合菌屬、芽生裂殖菌屬、馬拉色菌屬、毛孢子菌屬和隱球菌屬等[2]。

隨著研究的深入，科學(xué)家逐漸發(fā)現(xiàn)不同種類(lèi)的真菌均具有形成生物膜的能力。通過(guò)對(duì)白念珠菌生物膜的研究，對(duì)真菌生物膜形成過(guò)程中的分子機(jī)制也有了一定認(rèn)識(shí)[1,2]。病原真菌生物膜的形成是目前臨床抗真菌治療反應(yīng)不佳的重要原因，而清除生物膜所需抗真菌藥的血藥濃度卻遠(yuǎn)超出了臨床治療的上限。

2 生物膜基礎(chǔ)研究

細(xì)菌和真菌均可在單個(gè)分散游離狀態(tài)與固著多細(xì)胞群落狀態(tài)間相互轉(zhuǎn)換，后者通常就是生物膜狀態(tài)。生物膜是一種附著于介質(zhì)或細(xì)胞間相互黏著的高度結(jié)構(gòu)化細(xì)胞群落，由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)所包裹[2]。環(huán)境中約80%的微生物存在于生物膜群落中，微生物形成生物膜可以使其適應(yīng)環(huán)境，抵抗各種外源性應(yīng)激、壓力，提高代謝的協(xié)同作用。近年來(lái)，真菌生物膜的致病性日益受到臨床關(guān)注。生物膜不僅可以為其提供庇護(hù)（特別是對(duì)抗真菌藥物的耐受性[2]），也為微生物的持續(xù)性感染創(chuàng)造條件，且涉及越來(lái)越多的免疫缺陷人群[1]。真菌生物膜的形成是一個(gè)連續(xù)過(guò)程，包括黏附于介質(zhì)表面、形成微菌落、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、微菌落融合形成生物膜、生物膜成熟、真菌細(xì)胞從生物膜中釋放出來(lái)、形成新的生物周期。病原真菌細(xì)胞常常黏附和定植于留置導(dǎo)管、植入物及黏膜的表面，包括周?chē)|(zhì)（尿液、血液、 唾液和黏液）的化學(xué)成分、流動(dòng)性、pH 值、溫度、滲透壓、細(xì)菌、抗感染藥物以及宿主的免疫狀態(tài)等，多種因素影響真菌生物膜的形成與成熟[3]。

3 生物膜耐藥性研究

早期對(duì)生物膜耐藥性的研究是通過(guò)對(duì)其基本表型水平的描述性分析來(lái)評(píng)價(jià)抗真菌藥物的作用。干重法、四氮唑溴鹽（MTT）還原反應(yīng)、亮氨酸摻入法及靜態(tài)和動(dòng)態(tài)模型可用于研究白念珠菌生物膜活力及生物膜對(duì)抗真菌藥敏感性的變化[4]。但上述模型構(gòu)建繁瑣，因此，高效快速的二甲氧唑黃（XTT）比色法開(kāi)始逐步應(yīng)用于酵母菌的黏附力和藥敏的研究[5]。但XTT 比色法對(duì)生物膜的特征不能進(jìn)行量化分析，因此，這種方法僅適用于直接的、孤立的、未經(jīng)處理的對(duì)照研究，而非絕對(duì)定量分析生物膜形成本身。Martinez 和 Casadevall[6]于2006 年開(kāi)發(fā)了一種基于微量滴定板來(lái)檢測(cè)新生隱球菌生物膜對(duì)藥物的敏感性。96 孔微量培養(yǎng)板已用于曲霉生物膜的藥敏檢測(cè)，XTT 簡(jiǎn)化法和阿拉馬藍(lán)法用于研究分生孢子、菌絲的耐藥性[7]。

生物膜周?chē)后w的流動(dòng)性可以改變其對(duì)藥物的敏感性[4]，越來(lái)越多的流體生物膜模型體系被構(gòu)建并用于生物膜的研究[3]。Lopez Ribot 研究小組最近研究了一種簡(jiǎn)單的以重力為基礎(chǔ)的流體真菌生物膜模型，構(gòu)建的生物膜較厚且對(duì)多烯類(lèi)和棘白菌素類(lèi)抗真菌藥的耐藥性更強(qiáng)。此外，目前已經(jīng)構(gòu)建了許多用于體內(nèi)研究的生物膜模型，包括皮下植入模型、靜脈導(dǎo)管模型、陰道模型及義齒模型[7],這有助于進(jìn)一步研究真菌生物膜的體內(nèi)耐藥性。

4 真菌生物膜耐藥機(jī)制

對(duì)抗真菌藥物的耐藥性是生物膜的重要特征。研究顯示，真菌生物膜比浮游細(xì)胞耐藥性高1 000 倍左右，但其耐藥機(jī)制尚未完全闡明[8]。盡管一些抗真菌藥物（棘白菌素和脂質(zhì)體兩性霉素B）能夠抑制真菌生物膜，但生物膜復(fù)雜結(jié)構(gòu)所致的內(nèi)源性耐藥機(jī)制有待于進(jìn)一步研究[9]。真菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥較復(fù)雜，可以是化合物的誘導(dǎo)反應(yīng)，或?qū)拐婢幍拈L(zhǎng)期暴露引起的不可逆轉(zhuǎn)的遺傳學(xué)變化?？拐婢退帣C(jī)制包括靶分子的改變或過(guò)度表達(dá)，流出泵的外排，細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞密度升高等。

4.1 生長(zhǎng)條件

菌群的生長(zhǎng)環(huán)境特征影響著生物膜的藥物敏感性。葡萄糖和鐵離子使白念珠菌生物膜對(duì)兩性霉素B 的耐藥性升高[10]。此外，在缺氧狀態(tài)下形成的白念珠菌生物膜對(duì)兩性霉素B 和唑類(lèi)抗真菌藥物具有較高的耐藥性。pH值、溫度、氧氣及環(huán)境變化等其他影響因素都會(huì)影響生物膜的結(jié)構(gòu)及對(duì)抗真菌藥的敏感性[6]。在pH 為7.0 的中性環(huán)境中，白念珠菌黏附聚苯乙烯表面的能力更強(qiáng)[6]，與在YNB 中形成的生物膜相比，在RPMI1640 培養(yǎng)基中形成的生物膜對(duì)卡泊芬凈更加耐受。有研究顯示，念珠菌可以在厭氧環(huán)境（如牙周袋）及缺氧條件下形成生物膜，并導(dǎo)致多種感染[11]。

4.2 細(xì)胞密度

酵母狀態(tài)和絲狀結(jié)構(gòu)并存的生物膜菌群中，細(xì)胞密度是生物膜產(chǎn)生耐藥性，特別是對(duì)唑類(lèi)藥物耐藥的重要因素。游離細(xì)胞和重懸的生物膜細(xì)胞在低細(xì)胞數(shù)量（103個(gè)/ml）時(shí)對(duì)唑類(lèi)藥物敏感，當(dāng)細(xì)胞密度增長(zhǎng)后耐藥性也隨之增加[12]，這種現(xiàn)象在煙曲霉生物膜中也可觀察到。生物膜耐藥性的調(diào)控通路尚不清楚，且棘白菌素類(lèi)藥物具有較強(qiáng)的抗生物膜作用，也說(shuō)明細(xì)胞密度的影響是有限的[13]。此外，與浮游細(xì)胞相比，生物膜重懸分離細(xì)胞仍具有一定耐藥性，說(shuō)明生物膜還存在其他耐藥機(jī)制[7]。

4.3 藥物靶點(diǎn)的過(guò)度表達(dá)

唑類(lèi)藥物對(duì)白念珠菌的抑制作用引起了菌群的自然選擇可達(dá)到誘導(dǎo)耐藥作用。ERG11 基因的點(diǎn)突變（S405F，Y132H，R467K 和G464S 突變）或過(guò)度表達(dá)與其耐藥的關(guān)系比較明確[14]。通過(guò)基因芯片對(duì)白念珠菌的研究發(fā)現(xiàn)，其生物膜狀態(tài)CaERG25 和CaERG11 基因出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)[15]。生物膜的早期和晚期麥角固醇生物合成相關(guān)CaERG1，CaERG3，CaERG11 以及 CaERG25 的表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致真菌對(duì)氟康唑耐藥。特別是22 h 生物膜形成后，CaSKN1 及CaKRE1 的中度上調(diào)可導(dǎo)致生物膜對(duì)兩性霉素B 耐受[16]。同樣，近平滑念珠菌生物膜中也出現(xiàn)了麥角固醇合成基因的表達(dá)上調(diào)，以及對(duì)唑類(lèi)藥物的耐受。

4.4 藥物外排泵

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC）和易化載體蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）是白念珠菌對(duì)唑類(lèi)耐藥的主要機(jī)制[17]。多種抗真菌藥均可以作為這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，它們的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致不同藥物之間的交叉耐藥性，特別是唑類(lèi)藥物。生物膜對(duì)棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物的敏感性也受到外排泵的影響[18]。生物膜藥物外排泵基因包括CaCDR1、CaCDR2 和CaMDR1[19]，在生物膜形成過(guò)程中均有表達(dá)，特別是在暴露于抗真菌藥后出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。在生物膜形成的24 h 和48 h，CaCDR1 和CaCDR2 的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，CaMDR1 在第24 h 出現(xiàn)短暫上調(diào)[20]。動(dòng)物研究表明,植入導(dǎo)管相關(guān)生物膜也有外排泵基因的表達(dá)[16]，在12 h，CaCDR2 轉(zhuǎn)錄基因上調(diào)1.5 倍，CaMDR1 在12 h 和24 h 分別上調(diào)2.1倍和1.9 倍[15]。對(duì)光滑念珠菌的研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜形成的早期(6 h)、中期(15 h)及晚期(48 h)，CgCDR1 和CgCDR2 均有表達(dá)。與浮游細(xì)胞相比，CgCDR1 上調(diào)1.5 ～3.3 倍，CgCDR2 上調(diào)0.5 ～3.1 倍[21]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜形成晚期，藥物外排泵的缺失可以導(dǎo)致白念珠菌生物膜耐藥性降低[12]。

4.5 細(xì)胞外基質(zhì)

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是真菌生物膜的重要特征，幫助細(xì)胞對(duì)抗宿主免疫系統(tǒng)和抗真菌藥物所致?lián)p害[3]。ECM 阻止或延遲了藥物的滲入，最新的研究顯示ECM 的化學(xué)成分及其調(diào)控機(jī)制在生物膜耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。β-1,3 葡聚糖是碳水化合物主要組成部分，可以通過(guò)抑制1,3-β-D-葡聚糖合成酶，從而抑制生物膜的形成[4]。此外，β-1,3 葡聚糖酶可明顯增加氟康唑和兩性霉素B 的活性。外源性給予生物膜ECM 和β-1,3 葡聚糖可降低氟康唑體外抗真菌活性。研究表明，β-1,3 葡聚糖可以螯合唑類(lèi)抗真菌藥物，稱(chēng)之為“藥物海綿”，是白念珠菌生物膜耐藥的重要原因[23]。此外，β-1,3 葡聚糖還與棘白菌素類(lèi)，嘧啶類(lèi)和多烯類(lèi)抗真菌藥物的耐藥性有關(guān)。白念珠菌ECM 的產(chǎn)生受到多方面調(diào)控，ECM 不僅是白念珠菌生物膜也是非白念珠菌生物膜，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和都柏林念珠菌產(chǎn)生耐藥性的重要因素。

4.6 應(yīng)激反應(yīng)

應(yīng)激反應(yīng)已被證實(shí)是抗真菌藥耐受的重要機(jī)制。病原真菌需要面對(duì)多種來(lái)源的生理應(yīng)激，包括溫度、離子、滲透壓和氧化應(yīng)激[14]，這些應(yīng)激原與不同的受體結(jié)合，通過(guò)傳統(tǒng)信號(hào)通路引起反應(yīng),通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)參與生物膜的形成。此外，與野生型和游離菌株相比，Mck1p 基因突變株對(duì)唑類(lèi)藥物敏感，表明Mck1p 通過(guò)應(yīng)激通路參與生物膜的耐藥性。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是白念珠菌對(duì)唑類(lèi)耐藥的關(guān)鍵，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶與體內(nèi)外生物膜對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥物耐受的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[24]。熱休克蛋白90(Hsp90)通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞通路對(duì)真菌生物膜進(jìn)行調(diào)節(jié)，并增強(qiáng)了白念珠菌生物膜對(duì)唑類(lèi)和棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物的耐受，其中部分是通過(guò)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶起作用[25]。Hsp90 可以物理性地催化鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的亞基，且保持其穩(wěn)定及其活性。Cowen 和Lindquist[25]以及Singh 等[26]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90 基因的缺失抑制了白念珠菌生物膜的生長(zhǎng)和體外細(xì)胞的成熟，并引起生物膜細(xì)胞的離散，同時(shí)降低白念珠菌生物膜對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥的耐受。煙曲霉Hsp90 的缺失會(huì)導(dǎo)致生物膜對(duì)棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物的耐受性降低[27]。此外，光滑念珠菌生物膜蛋白質(zhì)組的研究表明，熱休克蛋白12（Hsp12p）和其他反應(yīng)蛋白質(zhì)（Trx1p，Pep4p）的表達(dá)上調(diào)也與生物膜耐藥性相關(guān)[28]。

5 總結(jié)

真菌生物膜的耐藥機(jī)制由復(fù)雜的、多種機(jī)制共同參與，包括一些基本的物理性屏障作用和一些復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。外排泵主要在生物膜形成的早期到中期逐漸發(fā)揮作用，后期ECM 的產(chǎn)生也增強(qiáng)了生物膜的耐藥性。成熟而致密的生物膜形成的物理屏障和環(huán)境壓力下的低生長(zhǎng)代謝率均有利于生物膜的生存。此外，致密生物膜可以抑制抗真菌藥物的滲透，菌絲生長(zhǎng)及麥角固醇同樣影響生物膜的耐藥性，環(huán)境中應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)揮著保護(hù)和維持生物膜穩(wěn)定性的作用?？傮w而言，生物膜耐藥性是受多方面調(diào)控的動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程。

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