基于數(shù)字編碼法的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)探究

朱敏瑩 宋志南

（上海第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

根據(jù)表型或者基因型，可將細(xì)菌鑒定方法分為兩大類，前者有雙歧索引法[1]、表解法[2]和數(shù)字編碼法等，它們經(jīng)過了多年的研究與歸納，逐步地發(fā)展、完善和創(chuàng)新，實現(xiàn)了自動化、商品化、標(biāo)準(zhǔn)化，在現(xiàn)階段是細(xì)菌鑒定的主流方法[3]；后者有G + C % mol含量測定、16S rRNA測序法[4]等，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，它將逐步成為主流方法。

1 細(xì)菌鑒定的三大傳統(tǒng)方法

1.1 雙歧索引法

所謂雙歧，即二者取一、非此即彼。生化反應(yīng)的大部分都是定性反應(yīng)，如革蘭染色反應(yīng)、觸酶試驗、氧化酶試驗等。雙歧索引法根據(jù)細(xì)菌的主要特性和次要特性，按照“非此即彼”的原則依次往下區(qū)分，直至將細(xì)菌準(zhǔn)確區(qū)分到最小鑒定單位，即屬或種的水平。

這種方法的優(yōu)點是具有很強(qiáng)的邏輯推斷性，思維嚴(yán)謹(jǐn)、思路清晰，所導(dǎo)出的結(jié)果明確有力。缺點是每一步都建立在前次實驗的結(jié)果之上，鑒定過程費時費力，且早期誤差易被放大，從而導(dǎo)致完全錯誤的結(jié)果。

1.2 表解法

所謂表解，即是通過表格的形式，列出有一定關(guān)聯(lián)性的細(xì)菌進(jìn)行相同生化試驗的結(jié)果。《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》上有大量的生化反應(yīng)結(jié)果表格[5]，都可以作為此法的判斷依據(jù)。

表解法主要解決了雙歧索引法實驗過程冗長的問題。它的優(yōu)點是可以通過人的主觀推理以“走捷徑”的方式判斷出結(jié)果。缺點是可能會因主觀判斷的失誤而影響試驗選擇的客觀性，并導(dǎo)致不易察覺的錯誤結(jié)果。

1.3 數(shù)字編碼法

通過長時間的實驗積累，人們發(fā)現(xiàn)對某一種細(xì)菌的某一個生化反應(yīng)而言，其結(jié)果雖然是定性的，但卻不是完全不變的，即存在一定概率出現(xiàn)與大部分情況截然相反的結(jié)果[6]。在實際操作中往往由于這一點，使雙歧索引法和表解法存在不可避免的誤差。

而數(shù)字編碼法正是建立在這種反應(yīng)不確定性的基礎(chǔ)上的。它以細(xì)菌的各種特性和反應(yīng)是同等重要的為理論基礎(chǔ)，根據(jù)每種生化反應(yīng)在不同細(xì)菌中出現(xiàn)的概率進(jìn)行全面分析而得出結(jié)果[5]。作為一種傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法，它結(jié)合了雙歧索引法和表解法，并通過與數(shù)理統(tǒng)計學(xué)的學(xué)科交叉而產(chǎn)生。

2 API系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)——數(shù)字編碼法

2.1 數(shù)字編碼理論的建立

在長時間的發(fā)展過程中，人們發(fā)現(xiàn)同一種而不同株的細(xì)菌，在同一個生化反應(yīng)下，結(jié)果會發(fā)生變化。這個現(xiàn)象一直干擾著細(xì)菌鑒定的精確度和準(zhǔn)確性。

為了解決這一問題，1962年Beers等[7]提出用概率值來表示某生化試驗在指定細(xì)菌分類群中的陽性率。這是第一次將數(shù)理統(tǒng)計學(xué)應(yīng)用于細(xì)菌鑒定學(xué)中。1968年Dybowski等[6]用條件概率法對肝腸菌科細(xì)菌進(jìn)行鑒定，首次提出了相對相似百分比PRL（Percentage Relative Likelihood）和模式分?jǐn)?shù)MLF（Modal Likelihood Fraction）這兩個數(shù)值鑒定參數(shù)，這為后續(xù)的探索鋪平了道路。1970年Lapage等[8]用概率法對279株革蘭陰性桿菌進(jìn)行鑒定，鑒定正確率達(dá)到了70%以上，從此基于概率論的細(xì)菌鑒定法受到了重視。1973年Lapage[9]繼續(xù)深入地探索了這一方法，并且建立了科學(xué)的細(xì)菌數(shù)字編碼鑒定的數(shù)理模型，數(shù)字編碼法正式得到認(rèn)可。在這之后，法國梅里埃公司在Lapage的理論基礎(chǔ)上提出了參數(shù)T值，并建立了可信度評價標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步完善了這一理論。

2.2 數(shù)字編碼理論的解析

2.2.1 鑒定系統(tǒng)的內(nèi)部計算方法

細(xì)菌數(shù)字編碼鑒定法以Bayer理論和Lapage理論為基礎(chǔ)，以細(xì)菌條目、鑒定試驗和概率這三大要素為數(shù)據(jù)，經(jīng)過統(tǒng)計計算給出結(jié)果。

在實踐中，學(xué)校將課程分為道德、人文、科學(xué)、健康、藝術(shù)五大學(xué)習(xí)領(lǐng)域，每一領(lǐng)域又包含基礎(chǔ)性、拓展性兩類課程。無論是基礎(chǔ)性課程，還是拓展性課程，都圍繞上面的五個領(lǐng)域落實并強(qiáng)化五種素養(yǎng)。為了提高學(xué)生的綜合素養(yǎng)，學(xué)校還打破學(xué)科與學(xué)科之間、課內(nèi)與課外之間、校內(nèi)與校外之間的壁壘，突破傳統(tǒng)課程模式，自主開發(fā)了各類綜合性課程。目的是通過課程體系的建構(gòu)、課程方案的落實，實現(xiàn)“為學(xué)生的幸福人生奠基”的辦學(xué)理念。

法國梅里埃公司的API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)是數(shù)字編碼法最典型的代表，也是現(xiàn)今使用最廣泛的一個鑒定系統(tǒng)。API系統(tǒng)在細(xì)菌鑒定方面有15個品種，分別具有相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。它將需要用到的生化反應(yīng)全部集成于一個PVC材質(zhì)的試劑條里，可以達(dá)到快速反應(yīng)讀取結(jié)果的目的。

以API鑒定系統(tǒng)為例，作為對結(jié)果的評價依據(jù)所計算的參數(shù)有以下幾個。

1) %ID值 即鑒定百分率。是每個細(xì)菌條目生化反應(yīng)的出現(xiàn)概率值與該細(xì)菌條目所在分類菌群中的所有細(xì)菌條目生化反應(yīng)出現(xiàn)概率值總和的比值。它表示的是每種細(xì)菌出現(xiàn)的可能性。以微球菌科為例，表1是截取自API V4.0 STAPH數(shù)據(jù)庫中的反應(yīng)鑒定表，表中的數(shù)字部分表示該細(xì)菌條目于該反應(yīng)的陽性反應(yīng)概率。

表1 API V4.0 STAPH 反應(yīng)鑒定表a)（部分）[10]

表中第二行以某一未知細(xì)菌的檢驗結(jié)果為例，其%ID值的計算步驟如下：

(1)假設(shè)該細(xì)菌條目為金黃色葡萄球菌，計算各反應(yīng)的出現(xiàn)頻率。

(2)如LAC為陽性，則該反應(yīng)的出現(xiàn)頻率FLAC=88/100。

(3)如TRE為陰性，則該反應(yīng)的出現(xiàn)頻率FTRE=1–(80/100)。

(4)若陽性反應(yīng)概率為0或100，則用近似值0.01和0.99代替。

(5)計算每一個反應(yīng)的出現(xiàn)頻率。在一個細(xì)菌條目中，將該條目所有反應(yīng)的出現(xiàn)頻率相乘，得出此細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率(式1)。

(6)按照上述方法，計算該分類菌群中所有細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率。

(7)計算整個分類菌群的多項總發(fā)生頻率。將該分類菌群中所有細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率相加，得到多項總發(fā)生頻率(式2)。

(8)計算某一細(xì)菌條目的%ID值。將某細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率除以多項總發(fā)生頻率，再乘以100，即得到該細(xì)菌條目的%ID值(式3)。

2) T值 為某細(xì)菌條目的總出現(xiàn)頻率除以該細(xì)菌條目最典型菌的總出現(xiàn)頻率得到的值(式4)。T值代表的是個體相較于最普遍情況的近似性。越接近1，表示鑒定結(jié)果的價值越大。

3) R值 %ID按大小排序之后，相鄰兩項條目的%ID之比，代表兩種可能性之間的差距。R值越大，表明結(jié)果之間的差距越大，鑒定結(jié)果的價值也越大。

2.2.2 API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)

當(dāng)使用試劑條后，讀取反應(yīng)的結(jié)果，并輸入電腦，由梅里埃公司的ATBNew軟件計算得出此次結(jié)果的%ID值和T值。計算過程完成后，系統(tǒng)會根據(jù)%ID的大小，將結(jié)果降序排列，并對結(jié)果作出評價。具體評價方法如下。

1) 排在第一位的細(xì)菌條目%ID≥80時，其評價方法如表2所示：

表2 第一位細(xì)菌條目%ID≥80時的評價方法

2) 排在第一位的細(xì)菌條目%ID＜80時：

排在前三位的細(xì)菌條目%ID之和≥80的，根據(jù)這些菌的歸類，如果是同一菌種下的不同菌株，則結(jié)果為鑒定到種水平。如果是同一屬下的不同菌種，則結(jié)果為鑒定到屬水平。鑒定的評價則為他們%ID之和，再依據(jù)上節(jié)所述作出。如果既不屬于同一種，也不屬于同一屬，則結(jié)果為低分辨率。

如排在前三位的菌名%ID之和仍然＜80，則結(jié)果為不可接受。

2.3 數(shù)字編碼法的發(fā)展

西方國家在20世紀(jì)70年代就開始此方面的研究，由于起步較早，他們的產(chǎn)品已經(jīng)具有很高的專業(yè)化、自動化、商品化、標(biāo)準(zhǔn)化的水平。其中具有代表性的有梅里埃 API系統(tǒng)，Vitek 系統(tǒng)[11]，Microscan Walkaway[12]和BD Phoenix[13]等。國內(nèi)在這方面的研究從20世紀(jì)90年代才開始，起步較晚，但也有不少具有代表性的產(chǎn)品，如杭州天和HW-138細(xì)菌鑒定分析儀[14]、山東鑫科XK-3401自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)[15]等，上海華山醫(yī)院也有自主研發(fā)的肝腸菌科細(xì)菌鑒定板條[16]。

總體來看，進(jìn)口產(chǎn)品因為其準(zhǔn)確度高、配套設(shè)備成熟等原因，占據(jù)著主流市場，但又由于其技術(shù)壟斷，因此售價較高，使檢驗的成本居高不下。但隨著國內(nèi)技術(shù)的前進(jìn)，兩者之間的差距會越來越小，因此可以期待有更物美價廉的產(chǎn)品出現(xiàn)。

3 數(shù)字編碼法在實際應(yīng)用中需注意的問題

根據(jù)上述細(xì)菌鑒定方法的原理，可以知道要通過傳統(tǒng)方法使鑒定結(jié)果完全可信是不可能的。根據(jù)式1、式2、式3可知，因為F細(xì)菌條目＜F總，所以%ID＜1，即鑒定結(jié)果的可信度始終不會是100%，即使是標(biāo)準(zhǔn)菌株，其%ID值也不會為1。因為這個方法建立在概率論與統(tǒng)計學(xué)的基礎(chǔ)上，支撐它的是前期大量數(shù)據(jù)的積累所形成的數(shù)據(jù)庫，但數(shù)據(jù)的積累都有局限性，而且其本身的算法也決定了%ID只可能接近1，而不可能等于1。

在平時的檢驗過程中，即使排除了操作上的誤差，也仍將難以避免地遇到低分辨率或鑒定失敗的結(jié)果。因此，必須在實際應(yīng)用中理性地審視實驗結(jié)果，既不能因為鑒定結(jié)果的%ID值相對較低而否定結(jié)論，也不能因為%ID值相對較高而迷信結(jié)論。這是傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法無法回避的一個局限性，但這并不代表實驗的結(jié)果完全沒有價值，我們可以通過一些方法來改善這一問題。

為了提高結(jié)論的準(zhǔn)確度和可信性，我們大致可以采用以下兩種方法。其一是復(fù)核試驗法，根據(jù)鑒定結(jié)果選擇一個或幾個生化反應(yīng)進(jìn)行復(fù)試（我們一般依照表解法的思路來進(jìn)行選擇），再根據(jù)復(fù)試結(jié)果來評價鑒定結(jié)果。其二是平行試驗法，即采用兩種方法或兩個系統(tǒng)進(jìn)行平行試驗、比對結(jié)果，例如同時使用API系統(tǒng)和16S rRNA序列分析法。

4 各鑒定方法的優(yōu)缺點比較

雙歧索引法和表解法作為最傳統(tǒng)的方法其優(yōu)點是硬件條件要求低，缺點是準(zhǔn)確度不高，檢驗時間長、效率低，難以商品化、自動化。

數(shù)字編碼法的優(yōu)點是實驗簡單、快速，初期投入成本較低，上手難度低，準(zhǔn)確度較高，缺點是只能鑒定到種，實驗精度不夠，耗材成本較高。

16S rRNA序列分析法作為分子生物學(xué)細(xì)菌鑒定方法的代表，其優(yōu)點是準(zhǔn)確率和可信度高，實驗周期短、精度高，可以進(jìn)行同源性分析，缺點是相關(guān)的儀器較昂貴，對實驗人員素質(zhì)要求較高。但隨著技術(shù)的完善，這一類方法在當(dāng)下已漸漸普及，也將成為今后的主流。

5 結(jié)語

隨著質(zhì)量技術(shù)系統(tǒng)的不斷發(fā)展，細(xì)菌鑒定必將成為一個常規(guī)檢驗項目，在選擇和建立檢驗方法時要對各現(xiàn)有方法進(jìn)行充分的比較。我們經(jīng)過實踐和總結(jié)，認(rèn)為在初期應(yīng)選用以數(shù)字編碼法為基礎(chǔ)的檢驗方法，既能達(dá)到準(zhǔn)確快速檢驗的目的，也能兼顧成本、提高人員素質(zhì)。

但在使用API等方便快捷的細(xì)菌鑒定試劑條產(chǎn)品時也會出現(xiàn)一些問題，如輕視傳統(tǒng)的基礎(chǔ)實驗、對成熟的、商品化的產(chǎn)品過分信任和依賴等。這些問題會表現(xiàn)在如僅通過%ID和T值就斷定結(jié)果而忽視補充實驗[17]、出現(xiàn)不可接受的結(jié)果時不從劃線分離等最基本的步驟開始找原因。因此在使用這類快速鑒定產(chǎn)品時仍應(yīng)保持客觀性，尤其在確定建立方法的初期，更應(yīng)熟悉所用方法的原理和內(nèi)涵，熟練基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗的操作。即便是基因水平的新方法，也離不開最基本的微生物實驗操作，而對基本操作的忽視，會成為實踐中最大的潛在問題。

此外，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到傳統(tǒng)方法本身的局限性，基于分子生物學(xué)的方法在將來成為主流是大勢所趨。建議在積累了一定數(shù)據(jù)和經(jīng)驗之后，可以逐步嘗試16S rRNA測序法。

總之，對于普通企業(yè)而言，應(yīng)當(dāng)從簡到難、逐步深入、夯實基礎(chǔ)，不能跨越式地追求最新的方法。

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