李石營，袁 穎，王勇軍，丁 斐，顧曉松

（南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇 226001）

周圍神經(jīng)損傷后再生能力差，致殘率高，因此對神經(jīng)損傷和再生的研究是醫(yī)學領(lǐng)域里科學研究的熱點之一。周圍神經(jīng)具有內(nèi)源再生能力[1]，坐骨神經(jīng)離斷后的再生主要是背根節(jié)神經(jīng)元的軸突再生。L4-6節(jié)神經(jīng)元是聯(lián)系坐骨神經(jīng)的背根節(jié)神經(jīng)元[2]，因此，坐骨神經(jīng)的內(nèi)源再生能力主要有L4-6節(jié)的背根節(jié)神經(jīng)元的基因表達控制。然而在眾多基因中哪些基因啟動和調(diào)控神經(jīng)元的內(nèi)源再生能力，周圍神經(jīng)再生啟動及調(diào)控分子調(diào)控模式和機理，軸突再生分子理論假說是什么都不清楚?；蛐酒谘芯炕虻谋磉_變化中有快速高效的獨特優(yōu)勢，使其成為基因調(diào)控研究的強大工具[3-5]。背根節(jié)神經(jīng)元的軸突再生是由基因調(diào)控的，進一步探討軸突再生的分子調(diào)控模式和機理，以及軸突再生分子理論具有重要意義。借助基因芯片用系統(tǒng)生物學方法探討周圍神經(jīng)損傷與再生過程中背根節(jié)神經(jīng)元的基因表達和調(diào)控模式既往未見有文獻報道，本文借助基因表達譜芯片技術(shù)進行相關(guān)研究，以探討神經(jīng)再生的分子調(diào)控理論學說。

1 材料和方法

1.1 材料 坐骨神經(jīng)離斷模型的構(gòu)建和表達譜芯片制備，成年雄性SD大鼠被隨機分成9組，每組6只，復合麻醉劑(xylazine 10 mg/kg,ketamine 95 mg/kg,0.7 mg/kg acepromazine）麻醉后，左后肢外側(cè)坐骨神經(jīng)做 1cm 離斷，分別在手術(shù)后 0h，0.5h，3h，6h，9h，1d，4d，7d 和 14d，取 1 組模型大鼠 L4～6 節(jié)背根節(jié)神經(jīng)元，實驗設3次重復。mRNA的抽提用Trizol法（Invitrogen），具體操作參照說明書進行，基因芯片采用Agilent大鼠表達譜芯片，由上海國家工程研究中心完成。

1.2 方法 （1）表達譜芯片數(shù)據(jù)的獲?。盒酒瑪?shù)據(jù)采 用 Silicon Genetics’GeneSpring GX Version 10.0(Agilent technologies)進行歸一化（標準化）處理，去掉重復性不好的數(shù)據(jù)，然后所有數(shù)據(jù)與對照組（0 h）比較，設定變化倍數(shù)大于2倍而且T檢驗中P＜0.05的基因為顯著差異基因，用于進一步分析。（2）表達譜芯片數(shù)據(jù)的分析：挑選顯著差異的基因進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，借助 DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）在線分析軟件，對顯著差異基因進行GO（Gene Ontology）生物學過程（Biological Process）功能注釋[6]，根據(jù) P值選擇核心生物學過程，并篩選出對應的差異基因，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，所有時間點都和對照組（0 h）進行比較，行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。設定變化倍數(shù)大于2倍，且t檢驗中P＜0.05的基因為顯著差異基因。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因數(shù)量變化 坐骨神經(jīng)離斷后，近端坐骨神經(jīng)差異基因的數(shù)量表現(xiàn)為先上升再下降的趨勢[7]，但背根節(jié)神經(jīng)元呈現(xiàn)為波浪形的增加（表1），損傷后的0.5 h到3 h明顯增加，6 h有所下降，9 h又增加到一個相當高的數(shù)量，然后又有所下降，在4 d達最低值，然后又逐漸增加。

表1 坐骨神經(jīng)離斷后背根節(jié)神經(jīng)元中差異基因數(shù)量統(tǒng)計

2.2 核心生物學過程的差異基因數(shù)量變化 相對于對照組（0 h），一些生物學過程，大部分時間點差異基因所反映的變化P值都非常顯著，如刺激檢測（detection of stimulus）、G-蛋白偶聯(lián)受體的信號通路（G-protein coupled receptor protein signaling pathway）、細胞表面受體連接的信號轉(zhuǎn)導（cell surface receptor linked signal transduction）、防御反應（defense response）、炎癥反應（inflammatory response）、免疫反應（immune response）、神經(jīng)系統(tǒng)過程（neurological system process）、節(jié)律過程（rhythmic process）和軸突生成（axonogenesis）。結(jié)合形態(tài)學過程變化，我們認為這些是周圍神經(jīng)再生中，背根節(jié)神經(jīng)元比較核心的生物學過程，篩選和運算它們所包含的差異基因。結(jié)果顯示（圖1）信號檢測和傳遞的生物學過程，包括刺激檢測、G-蛋白偶聯(lián)受體的信號通路、細胞表面受體連接的信號轉(zhuǎn)導的差異基因數(shù)量均表現(xiàn)為波浪形的變化。防御反應、炎癥反應、免疫反應除3 h突然較高外，表現(xiàn)為持續(xù)性的增加，而節(jié)律過程和神經(jīng)系統(tǒng)過程均也表現(xiàn)為波浪形的增加，軸突生成除了3h外也表現(xiàn)為持續(xù)的增加。

圖1 核心生物學過程的差異基因數(shù)量變化

2.3 與軸突生成相關(guān)的差異基因的表達變化 坐骨神經(jīng)再生主要是神經(jīng)元軸突的再生，因此我們專門列舉了與神經(jīng)元軸突生成有關(guān)的基因及它們的表達變化。表 2 顯示 Lhx4、Nkx2-9、Efnb3、Titf1、Apoa4等基因表現(xiàn)為波浪形增加的變化趨勢。Mapk8ip3、Zfp312、Gap43等在長時間點表達增加。Tnn、Efnb1等基因表現(xiàn)為一開始就表達降低，Notch1、Nefl、Bmpr1b等基因表現(xiàn)為長時間點表達降低（表2）。

表2 與軸突生成相關(guān)的差異基因的表達變化

3 討 論

基因表達譜芯片能一次檢測大量的目標分子，具有多樣性、高通量和自動化的特點。它已成為高效、快速、大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段，在研究基因表達、疾病診斷和藥物篩選中有廣泛應用。我們已研究報道了近、遠端神經(jīng)的基因表達模式和生物學過程的變化規(guī)律[5，7-8]。而軸突再生的調(diào)控、控制中樞的背根節(jié)神經(jīng)元的總體基因表達變化及相應的調(diào)控模式尚未見報道。周圍神經(jīng)離斷后，背根節(jié)神經(jīng)元具有內(nèi)源的再生能力[1]。因此探討神經(jīng)元內(nèi)源再生能力的控制因素，解碼軸突再生的啟動和調(diào)控機制，以便能夠優(yōu)化和提高神經(jīng)元內(nèi)源的再生能力，對于改善和治療周圍神經(jīng)再生是非常必要的。

研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)離斷后，近端坐骨神經(jīng)差異基因的數(shù)量表現(xiàn)為一直上升，在7天達最大值，然后呈下降趨勢[7]，但背根節(jié)神經(jīng)元呈現(xiàn)為波浪形的增加。我們推測近端坐骨神經(jīng)是神經(jīng)的直接損傷和再生部位，所以在損傷后表現(xiàn)為穩(wěn)定的增加。但背根節(jié)神經(jīng)元卻是信號的反饋和指揮中樞，波浪形的變化說明背根節(jié)神經(jīng)元在接收信號、反饋和調(diào)控中的特點。進一步分析核心生物學過程的差異基因的變化規(guī)律，結(jié)果顯示信號檢測和傳遞及節(jié)律相關(guān)的生物學過程表現(xiàn)為波浪形的變化。而防御反應，免疫反應，炎癥反應和軸突生成表現(xiàn)為持續(xù)的增加，這一定程度上反映了背根節(jié)神經(jīng)元在坐骨神經(jīng)損傷與再生過程中的分子調(diào)控模式。我們也列舉了與軸突生成相關(guān)的基因及其表達變化。

總之，周圍神經(jīng)的內(nèi)源再生能力和再生過程是被一些核心基因所調(diào)節(jié)和控制。我們借助基因表達譜芯片，篩選了坐骨神經(jīng)離斷后L4～6背根節(jié)神經(jīng)元的差異表達基因，探討了這些差異基因所反映的核心生物學過程的變化特點，并分析了軸突生成相關(guān)的基因及其變化。這些結(jié)果一定程度上反映了背根節(jié)神經(jīng)元的分子調(diào)控模式，也為后續(xù)研究提供了必要的參考。

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