陳　淳，　蔡學(xué)定，　黃曉穎，　任卓超，　嚴(yán)建平△，　王良興△

(1浙江省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 杭州 310000;2溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000 )

急性肺栓塞(pulmonary thromboembolism , PTE)為臨床常見(jiàn)病、危重病[1]。急性PTE嚴(yán)重肺損傷和肺動(dòng)脈高壓是其引起死亡的直接原因。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，急性PTE性肺動(dòng)脈高壓形成與血栓的機(jī)械阻塞作用關(guān)系密切[1]。然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)急性PTE血栓的機(jī)械阻塞程度與肺動(dòng)脈壓力的增高并不一致，即使機(jī)械性阻塞已基本解除，仍存在肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高[2]。又有研究證實(shí)急性PTE時(shí)栓塞血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其釋放的細(xì)胞因子可進(jìn)一步加重肺動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷，在PTE性肺動(dòng)脈高壓的形成中起到不可忽視的作用[3]。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是活化和聚集單核炎癥細(xì)胞至血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要介導(dǎo)者。Eagleton等[4]發(fā)現(xiàn)在PTE早期，肺動(dòng)脈壁中MCP-1表達(dá)明顯升高同時(shí)快速趨化炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)至肺動(dòng)脈壁周圍?？梢?jiàn)，在啟動(dòng)血管的炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中MCP-1是關(guān)鍵的炎癥趨化因子, MCP-1與栓塞性肺動(dòng)脈高壓形成密切相關(guān)。

p38有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組成部分之一，主要調(diào)控各種促炎癥因子[5]。多項(xiàng)研究指出激活p38 MAPK通道可以促進(jìn)MCP-1的大量表達(dá)，p38 MAPK是MCP-1產(chǎn)生的關(guān)鍵上游分子[6]。p38 MAPK抑制劑被廣泛應(yīng)用于p38 MAPK對(duì)腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、MCP-1等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)活性的研究。SB203580是 p38 MAPK特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑的突出代表[7]。目前，關(guān)于SB203580干預(yù)急性PTE后MCP-1表達(dá)以及肺動(dòng)脈高壓的療效和機(jī)制尚不明確。綜上所述，我們推測(cè)SB203580可能通過(guò)抑制急性PTE后MCP-1的表達(dá)，降低急性PTE肺動(dòng)脈高壓。

本研究通過(guò)復(fù)制大鼠急性PTE模型，應(yīng)用MCP-1中和抗體C1142及p38 MAPK特異性抑制劑SB203580對(duì)急性PTE后MCP-1表達(dá)的影響，評(píng)價(jià)MCP-1是否參與急性PTE性肺動(dòng)脈高壓的形成以及SB203580是否通過(guò)p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)MCP-1的表達(dá)，從而降低急性PTE性肺動(dòng)脈高壓。

材　料　和　方　法

1材料

1.1動(dòng)物SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)健康雄性Sprague-Dawley大鼠150只，體重300～350 g，溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證為SCXK(浙)2005-0019。動(dòng)物采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2試劑和儀器多克隆兔抗鼠MCP-1抗體(AB.cam)，SB203580(Sigma)，SYBR Green Real-time PCR Master (Toyobo)，C1142(Centocor)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol(Gibco)，PowerLab(AD Instruments)，Bio-Rad PCR System S1000 (Bio-Rad)，聚乙烯導(dǎo)管-1106(中國(guó)浙江寧波安來(lái)生命科學(xué)軟件及器械公司)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組150只 SD 大鼠按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為正常對(duì)照(C組)、溶劑對(duì)照組(S組)、急性PTE組(PTE組)、急性PTE+ SB203580(PTE+SB組)和急性PTE+C1142(MCP-1特效中和抗體)組,各組觀察1 h、4 h和8 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)，每組10只。

2.2急性PTE大鼠模型建立所有大鼠頸部剃除皮毛并對(duì)皮膚進(jìn)行消毒，分離左頸動(dòng)脈并接入19G頭皮針留取0.5 mL血液使血栓形成。待血栓凝固后將其切成約1 mm×1 mm×3 mm大小的栓子。分離右頸靜脈并插入裝有血栓的聚乙烯導(dǎo)管-1106并與 PowerLab連接。為最大程度地降低血栓輸注過(guò)程中大鼠的致死率，設(shè)置血栓(180 mg/kg)輸注時(shí)間大于5 min。并根據(jù)信號(hào)采集器顯示的右心室壓力控制在40 mmHg以保證最適宜的血栓輸入量[8]。C組和S組分別輸注等量的0.9%生理鹽水和1% DMSO代替血栓，其余操作相同。分別在各組大鼠血栓輸注后1 h、4 h和8 h，采用改良右心導(dǎo)管法[9]進(jìn)行肺動(dòng)脈平均壓力(mean pulmonary artery pressure, MPAP)測(cè)量。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

2.3C1142及SB203580藥物干預(yù)PTE+C1142 組在復(fù)制急性肺栓塞模型前1 h予尾靜脈注射C1142 2 mg/kg[10](溶于1%的DMSO)；PTE+SB 組復(fù)制急性PTE模型前1 h予尾靜脈注射SB203580 2.5 mg/kg[11](溶于1%的DMSO)；C組于大鼠尾靜脈注入等量無(wú)菌生理鹽水；S組大鼠尾靜脈注射等量 1% DMSO溶液；以上操作均在無(wú)菌條件下完成。

2.4標(biāo)本收集各組大鼠均行下腔靜脈取血后處死，切取部分肺組織予4%多聚甲醛固定作免疫組化檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)，部分肺組織放入無(wú)菌去酶凍存管中經(jīng)過(guò)液氮速凍后再于-70 ℃冰箱保存，并行real-time PCR及Western blotting檢測(cè)肺組織MCP-1 mRNA及蛋白表達(dá)。

2.5Real-time PCR檢測(cè)MCP-1 mRNA表達(dá)使用Trizol從100 mg快速冰凍組織中萃取總RNA。RNA濃度定量在波長(zhǎng)260 nm處的吸光度，RNA純度在波長(zhǎng)260和280 nm (A260/A280)被檢測(cè)。取1 μg總RNA與2 μL 5×RT Buffer, 0.5 μL RT Enzyme Mix, 0.5 μL Primer Mix 在Bio-Rad PCR System S1000上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物溶于10 μL去RNA酶水中備用。MCP-1上游引物5’-GTCTCTGTCACGCTTCTG-3’，下游引物5’-TGCTGGTGATTCTCTTGTAG-3’。內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-AGAACATCATCCCTGCATCC-3’ 下游引物5’- TGGATACATTGGGGGTAGGA-3’。PCR參數(shù)設(shè)置如下： 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 62 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。所有PCR結(jié)果由ABI 7500 System SDS軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法分析。

2.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)將肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后用石蠟包埋切片，將切片放入含兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體室溫下孵育2 h，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗共同孵育1 h，最后用含二氨基聯(lián)苯的底物顯色，蘇木精反染。Ⅰ抗用PBS代替作為空白對(duì)照組。黃色代表陽(yáng)性并按黃色深淺代表陽(yáng)性強(qiáng)弱。

2.7Western blotting 檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)肺組織蛋白濃度均使用BCA法檢測(cè)。采用15%分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE。分別用兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體(1∶500)的單抗 4 ℃封閉過(guò)夜后再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)孵育2 h。化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析各組蛋白表達(dá)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1動(dòng)物一般情況以及模型建立

大鼠自體PTE模型制備成功率為92.7% (102/110)，死亡率為7.3% (8/110)。大鼠出現(xiàn)呼吸加快加深、口唇發(fā)紺、兩肺彌漫性干濕啰音等PTE體征。大體組織見(jiàn)肺膨脹不全,多散在出血灶,肺組織光鏡見(jiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)有注入的血栓，同時(shí)見(jiàn)肺血管壁肌層組織水腫，提示急性PTE模型復(fù)制成功，見(jiàn)圖1。

Figure 1. HE staining showed the pulmonary artery walls and thrombi in pulmonary tissues of control group and PTE group (×200).

圖1HE染色示正常對(duì)照組及PTE組大鼠肺組織肺動(dòng)脈壁變化及血栓形成

2SB203580及C1142對(duì)急性PTE大鼠MPAP的影響

S組MPAP較C組有降低趨勢(shì)，但兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；急性PTE組MPAP顯著高于S組，PTE+SB組MPAP顯著低于急性PTE組，PTE+C1142組MPAP顯著低于急性PTE組，它們之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2. The waveform charts of pulmonary artery pressure in control group and acute PTE group. A: control group;B: acute PTE group.

圖2正常對(duì)照組和急性肺栓塞大鼠肺動(dòng)脈壓力波形圖

Figure 3. Mean pulmonary artery pressure (MPAP) in the five groups at the time points of 1, 4, and 8 h. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE.

圖3在1、4和8h時(shí)點(diǎn)各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力值

3Real-timePCR測(cè)量各組MCP-1mRNA在肺組織中的表達(dá)

各組大鼠肺組織MCP-1 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，急性PTE組MCP-1 mRNA表達(dá)的Ct值較S組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTE+SB組及PTE+C1142組MCP-1 mRNA Ct值均較急性PTE組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Effects of SB203580 and C1142 on the expression of MCP-1 mRNA. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖4Real-timePCR檢測(cè)各組MCP-1mRNA的表達(dá)

4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠MCP-1蛋白在肺組織內(nèi)的表達(dá)

各組大鼠肺組織免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，C、S組大鼠肺組織內(nèi)未見(jiàn)明顯MCP-1蛋白表達(dá)，急性PTE組MCP-1蛋白表達(dá)較S組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTE+SB組及PTE+C1142組MCP-1蛋白表達(dá)較急性PTE組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

5Westernblotting檢測(cè)各組大鼠肺組織MCP-1蛋白的表達(dá)

各組大鼠肺組織Western blotting檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，S組MCP-1蛋白表達(dá)與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，急性PTE組MCP-1蛋白表達(dá)較S組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTE+SB組及PTE+C1142組MCP-1蛋白表達(dá)均較急性PTE組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6、7。

討　　論

1急性PTE后MCP-1表達(dá)增加參與急性PTE后肺動(dòng)脈高壓形成

MCP-1屬于趨化因子家族。趨化因子是具有趨化白細(xì)胞作用的一類蛋白質(zhì)或多肽，可分為4類，即趨化因子CXC、趨化因子CC、趨化因子C、趨化因子CNC。MCP-1是趨化因子CC亞族其中一員，位于第17號(hào)染色體上，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、系膜細(xì)胞等[12]。它能夠趨化和活化諸如肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞[13]，使各種炎癥細(xì)胞向病變部位聚集，通過(guò)與各細(xì)胞上的CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2, CCR2)結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。近年來(lái)，研究證實(shí)在啟動(dòng)血管的炎癥反應(yīng)中MCP-1可能是關(guān)鍵的炎癥趨化因子，是活化和聚集炎癥細(xì)胞至血管內(nèi)皮的重要介導(dǎo)者[14]。又有報(bào)道指出，在大鼠PTE模型中觀察到MCP-1在肺組織、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中均有大量表達(dá)，表明MCP-1可能與PTE后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程密切相關(guān)[15]。

Figure 5. Localization of MCP-1 protein in lung tissues of acute PTE rats determined using immunohistochemistry(×100).Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖5免疫組化法測(cè)定各組大鼠肺組織中MCP-1蛋白的表達(dá)

Figure 6. Effect of C1142 on protein expression of MCP-1 in lung tissues of acute PTE rats measured by Western blotting. β-actin was used to normalize protein loading. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖6Westernblotting檢測(cè)C1142干預(yù)下各組MCP-1蛋白的表達(dá)

Figure 7. Effect of SB203580 on protein expression of MCP-1 in lung tissues of acute PTE rats measured by Western blotting. β-actin was used to normalize protein loading. Mean±SD.n=10.★P<0.05vssolvent;▲P<0.05vsPTE;#P<0.05vs4 h.

圖7Westernblotting檢測(cè)SB203580干預(yù)下各組MCP-1蛋白的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)，急性PTE 1 h和4 h組血栓幾乎阻塞了整個(gè)肺動(dòng)脈管腔，由于血栓機(jī)械阻塞作用MPAP顯著增高，急性PTE 8h組血栓對(duì)血管的機(jī)械阻塞作用較4 h組減少但MPAP值卻未降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。急性PTE由于體內(nèi)纖溶系統(tǒng)迅速激活[16]血栓開始溶解，為何肺動(dòng)脈壓力仍持續(xù)增高？目前認(rèn)為可能與栓塞血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其釋放的細(xì)胞因子加重肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷有關(guān)[3]，而MCP-1是活化和聚集單核炎癥細(xì)胞至血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要介導(dǎo)者。Eagleton等[4]發(fā)現(xiàn)在PTE后肺動(dòng)脈壁中MCP-1 表達(dá)量明顯升高。本實(shí)驗(yàn)也觀察到急性PTE 8 h組的MCP-1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高。因此，我們推測(cè)急性PTE后MCP-1的表達(dá)與急性PTE性肺動(dòng)脈高壓形成相關(guān)。為進(jìn)一步探討MCP-1表達(dá)與mPAP關(guān)系，我們?cè)? h、4 h和8 h分別加用MCP-1 特異性中和抗體C1142 進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，各相同時(shí)點(diǎn)PTE+C1142組mPAP值均較急性PTE組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明除血栓對(duì)肺動(dòng)脈的機(jī)械阻塞作用外，急性PTE后MCP-1的表達(dá)增高參與肺動(dòng)脈高壓的形成。因此，抑制MCP-1表達(dá)可能是降低急性PTE性肺動(dòng)脈壓力的一種有效手段。

2SB203580通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)MCP-1表達(dá)，從而降低急性PTE性肺動(dòng)脈高壓

MAPKs是生物細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。多項(xiàng)研究表明，MAPKs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞漿及其核內(nèi)，在引起生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等)過(guò)程中具有十分重要的作用[17]。MAPKs通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)和p38 MAPK等通路[17]。p38 MAPK通路是1993 年發(fā)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一旦被激活，細(xì)胞質(zhì)中的非磷酸化p38 MAPK轉(zhuǎn)化為磷酸化p38 MAPK，再移位到細(xì)胞核內(nèi)[17]。SB203580是p38 MAPK特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑的突出代表。p38 MAPK具有一個(gè)較小的氨基末端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較大的羧基末端結(jié)構(gòu)域，氨基末端結(jié)構(gòu)域主要由β折疊組成，羧基末端結(jié)構(gòu)域主要為α螺旋[18]。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域交界處形成一個(gè)裂隙，為ATP結(jié)合位點(diǎn)[17]。SB203580并不是通過(guò)抑制p38 MAPK上游激酶的活性發(fā)揮作用，而是結(jié)合于激活的p38 MAPK及未被激活的p38 MAPK的ATP口袋，從而抑制下游底物MK2的磷酸化及其功能的發(fā)揮[19]。

目前關(guān)于下調(diào)急性PTE后肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制尚不明確，既往研究證實(shí)p38 MAPK是MCP-1產(chǎn)生的關(guān)鍵上游分子，抑制p38 MAPK通道可以減少M(fèi)CP-1 的大量表達(dá)[17]。Gresele等[19]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在急性缺血性心臟疾病中可通過(guò)p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少大量炎癥趨化因子產(chǎn)生。Chakraborty等[20]亦報(bào)道白藜蘆醇可通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活減少炎癥反應(yīng)發(fā)生。由此推測(cè)，SB203580可能通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)MCP-1的表達(dá)，減少單核細(xì)胞的募集，減輕急性PTE后炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而降低肺動(dòng)脈壓力。為進(jìn)一步探究在急性PTE 后是否可通過(guò)抑制p38 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少M(fèi)CP-1的大量表達(dá)，我們加用p38 MAPK 通路特效抑制劑SB203580預(yù)孵育，結(jié)果顯示，各相同時(shí)點(diǎn)SB203580組MCP-1 mRNA及蛋白水平均較急性PTE組顯著降低，提示急性PTE 后SB203580通過(guò)抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下調(diào)MCP-1表達(dá)。這可能是SB203580降低急性PTE后肺動(dòng)脈高壓的重要機(jī)制。

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