楊明明，陳玉林

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，飼料資源緊張的矛盾凸顯。近年來(lái)用于生產(chǎn)飼料的糧食占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的比例節(jié)節(jié)攀升，預(yù)計(jì)到2020 年飼料糧用量占糧食總量的40%以上。與此同時(shí)，以木質(zhì)纖維素為主要成分的農(nóng)作物的副產(chǎn)品資源豐富，我國(guó)僅秸稈的年產(chǎn)量在5×108以上，是糧食產(chǎn)量的1～1.2倍。由于植物細(xì)胞壁的纖維素“難降解性”造成自然界存量最大的纖維素資源在畜牧業(yè)中沒(méi)有得到有效利用，甚至成為環(huán)境污染物。此外，植物性的能量飼料和蛋白飼料中的木質(zhì)纖維素不但自身難以降解，而且妨礙其他養(yǎng)分的消化吸收，降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成有限飼料資源的浪費(fèi)。利用木質(zhì)纖維素酶將木質(zhì)纖維素分解為可利用的養(yǎng)分是開(kāi)拓飼料資源和提高養(yǎng)分利用率的有效策略[1-5]。

纖維素酶多酶復(fù)合體(cellulosome)是存在于以木質(zhì)纖維素為養(yǎng)分的厭氧微生物中的高效協(xié)同降解木質(zhì)纖維素的多酶復(fù)合體[6]，具有在物理空間上聚集纖維素酶系、協(xié)同有效的降解木質(zhì)纖維素的特點(diǎn)[7-9]。纖維素酶多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)為纖維素酶的協(xié)同高效降解提供了新思路—人工纖維素酶多酶復(fù)合體。以下簡(jiǎn)要綜述纖維素酶降解木質(zhì)纖維素的研究進(jìn)展。

1 纖維素酶與粗飼料利用

隨著畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展，飼料資源緊張和人畜爭(zhēng)糧矛盾日益突出,飼料資源瓶頸成為困擾養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的一大難題。與此同時(shí)，以木質(zhì)纖維素為主要成分的農(nóng)作物的副產(chǎn)品資源豐富，在畜牧業(yè)中沒(méi)有得到有效利用，甚至成為環(huán)境污染物[1]。此外，植物性飼料的木質(zhì)纖維素作為抗?fàn)I養(yǎng)因子影響消化道養(yǎng)分的消化和吸收，浪費(fèi)飼料資源。

利用木質(zhì)纖維素酶將木質(zhì)纖維素分解為可利用的養(yǎng)分，是開(kāi)拓飼料資源和提高養(yǎng)分利用率的有效途徑。但是，我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用纖維素酶的比例很低，主要是飼用纖維素酶的產(chǎn)量和降解效果都不能滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)的要求。

木質(zhì)纖維素的降解是纖維素酶系與底物特異吸附、協(xié)同作用的結(jié)果[2]。目前在飼用纖維素酶的研究和應(yīng)用中，缺乏纖維素酶系的協(xié)同作用及與底物吸附等方面的研究和技術(shù)體系。植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)纖維素是以纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的嵌合方式存在，木質(zhì)纖維素的有效降解需要纖維素酶系和半木聚糖酶的協(xié)同作用[3-5]。

因此，通過(guò)基因工程方法提高纖維素酶產(chǎn)量降低使用成本，利用木質(zhì)纖維素酶的協(xié)同作用增加降解效果是緩解飼料資源緊張、提高養(yǎng)分利用率的有效策略。

2 纖維素酶及其調(diào)控基因

纖維素類物質(zhì)是地球上產(chǎn)量巨大而又未得到充分利用的可再生資源。纖維素酶系是參與纖維素降解的纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶等的總稱。纖維素酶系促進(jìn)植物細(xì)胞壁的降解，使植物細(xì)胞內(nèi)溶物釋放，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。同時(shí)，使用纖維素酶制劑可以促進(jìn)腸道內(nèi)源酶的分泌，維護(hù)動(dòng)物腸道消化吸收功能的正常。此外，纖維素酶還可以通過(guò)降解飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料養(yǎng)分利用率，改善動(dòng)物消化道微生態(tài)環(huán)境。因此纖維素酶在飼料行業(yè)中有十分重要的實(shí)用價(jià)值[1-2，10-13]。

自然界中，微生物和昆蟲(chóng)都能產(chǎn)生纖維素酶，通過(guò)微生物發(fā)酵方法是大規(guī)模制備纖維素酶的有效途徑。不同來(lái)源的纖維素酶在組成和酶解能力方面均有差異[3]。目前生產(chǎn)中采用的菌種大多是木霉、曲霉和青霉等，以木霉屬的得率最高[14]；而相對(duì)于真菌，細(xì)菌的纖維素酶分泌能力低(低于0.1 g/L)，且多屬于胞內(nèi)酶或細(xì)胞壁粘附性酶，難以進(jìn)行規(guī)?；纳a(chǎn)分離，因此應(yīng)用具有局限性。但是細(xì)菌源纖維素酶卻具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因背景清晰，容易進(jìn)行基因工程改造。因此，高活力的細(xì)菌酶源，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值[15-17]。

纖維素酶根據(jù)功能不同主要分為葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和β-葡聚糖苷酶。葡聚糖內(nèi)切酶(1,4-D-glueanohydrolase，EC 3.2.1.4)隨機(jī)水解可溶性纖維素的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生大量小分子纖維素；葡聚糖外切酶(1,4-β-D-glucan, EC3. 2.1.91)水解纖維素線狀分子末端的β-1，4糖苷鍵，每次酶解一個(gè)纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)；β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase, EC3.2.1.21)將纖維二糖水解成葡萄糖分子。由于底物的不溶性，在纖維素酶-底物的作用中，缺乏酶與底物形成ES復(fù)合物過(guò)程。纖維素酶首先特異性地吸附纖維素上，在外切酶作用下使纖維素易于水化，然后內(nèi)切酶作用于經(jīng)活化的纖維素，產(chǎn)生短鏈低聚糖，纖維二糖酶進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分解。這是一個(gè)協(xié)同作用過(guò)程，但該協(xié)同水解作用過(guò)程并不完全清楚，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

自1982年Cellulomonas fimi的纖維素酶基因首次被克隆以來(lái)，纖維素酶不斷從細(xì)菌與真菌中被發(fā)現(xiàn)和分離[18]。來(lái)源于里氏木霉的纖維二糖水解酶編碼基因cbh1和cbh2，纖維素內(nèi)切酶編碼基因eg1,eg2,eg3,eg4,eg5以及葡萄糖苷酶基因bgl2已陸續(xù)被報(bào)道, 并且在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。在其他細(xì)菌中也克隆到了不同的纖維素酶基因[4]，從Stropyomyces、Clostridium、Thermoanaerobacter、Themomonspora、Erwinia、Pseudomonas、Cellvibrio、Ruminococcus、Cellulomonas、Fibrobacter和Bacillus中均成功克隆了葡聚糖苷酶的編碼基因。從瘤胃細(xì)菌Bacteroidessuccinogenes、Butyrivibriosp、Ruminococcusalbus等的基因組中克隆到了纖維素酶基因；嗜纖維梭菌的纖維素內(nèi)切酶基因EngA、EngB、EngC、EngD和EngE已經(jīng)測(cè)序并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。Kim等[19]克隆了Aquifex aeolicus VF5編碼EG的ce18Y基因，并在E.coliXL1 -Blue中成功表達(dá)。Hakamada等[20]運(yùn)用盒式連接介導(dǎo)PCR 和反向PCR 克隆到了基因egl-257。

3 纖維素酶多酶復(fù)合體的類型

Lamed等[21]首次從厭氧微生物熱纖梭菌(C.thermocellum) 中發(fā)現(xiàn)并鑒定了纖維素酶多酶復(fù)合體。纖維素酶多酶復(fù)合體普遍存在于厭氧細(xì)菌和真菌中，它具有類似核糖體的大分子結(jié)構(gòu)，能協(xié)調(diào)、有序、高效地降解木質(zhì)纖維素[4，22]。目前發(fā)現(xiàn)的纖維素酶多酶復(fù)合體中，不僅含有纖維素酶系，而且還含有半纖維素酶，甚至一些大的纖維素酶多酶復(fù)合體中還含有果膠酶[8,23-24]。

纖維素酶多酶復(fù)合體由含有錨定蛋白域(dockerin)的各種木質(zhì)纖維素酶和腳手架蛋白(scaffoldin) 構(gòu)成，其中scaffoldin含有一個(gè)或多個(gè)粘附域(cohesin)、纖維素結(jié)合域(CBM)。木質(zhì)纖維素酶通過(guò)dockerin與scaffoldin上的cohesin特異性結(jié)合，組裝成纖維素酶多酶復(fù)合體，并通過(guò)CBM結(jié)合木質(zhì)纖維素[6,8-9，24]。

目前在厭氧微生物的纖維素酶多酶復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)了三種dockerin cohesin對(duì)，分別為type I，type II和type III[24]。來(lái)自C.thermocellum的CipA蛋白是最早被克隆的纖維素酶多酶復(fù)合體腳手架蛋白[25]。CipA含有9個(gè)type I cohesin 和1個(gè)type II dockerin，9個(gè)type I cohesin專一性識(shí)別結(jié)合木質(zhì)纖維素酶的type I dockerin, 1個(gè)type II dockerin識(shí)別細(xì)胞壁的type II cohesin[24-27]。細(xì)菌的纖維素酶多酶復(fù)合體腳手架蛋白分為復(fù)合型和簡(jiǎn)單型[24]。在嗜溫性厭氧菌C.cellulolyticum,C.cellulovorans,C.josui和C.acetobutylicum中，纖維素酶多酶復(fù)合體通過(guò)簡(jiǎn)單的腳手架蛋白結(jié)合6-9個(gè)木質(zhì)纖維素酶形成最簡(jiǎn)單的多酶復(fù)合體。有相當(dāng)一部分簡(jiǎn)單的多酶復(fù)合體缺乏type II dockerin，可以游離存在于培養(yǎng)基中。在R.flavefaciens中發(fā)現(xiàn)了序列和結(jié)構(gòu)不同于type I和type II的dockerin cohesin對(duì)，命名為type III dockerin cohesin對(duì)[24]。type I，type II和type III的結(jié)構(gòu)域間相互不識(shí)別。此外，type I的dockerin cohesin相互作用具有種屬專一性，而type II的dockerin cohesin識(shí)別可以跨越種屬。

自然存在的纖維素酶多酶復(fù)合體在物理空間上聚集于木質(zhì)纖維素表面，多種木質(zhì)纖維素酶局部高濃度的協(xié)同作用，從而高效的降解木質(zhì)纖維素。顯然，纖維素酶多酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和作用方式為飼用木質(zhì)素的高效降解提供了一個(gè)新的策略—多酶復(fù)合體的協(xié)同高效降解。

4 纖維素酶多酶復(fù)合體的構(gòu)建

在纖維素酶多酶復(fù)合體中，參與降解木質(zhì)纖維素的酶如果排列組合適當(dāng)，在保證濃度的條件下，可以高效協(xié)同的降解木質(zhì)纖維素。因此，近年來(lái)提出了人工設(shè)計(jì)型纖維素酶多酶復(fù)合體的概念[24，28-29]。利用設(shè)計(jì)型纖維素酶多酶復(fù)合體可以對(duì)不同結(jié)構(gòu)域的功能、不同酶的協(xié)同效果、多酶空間聚集效應(yīng)和底物靶向結(jié)合作用等進(jìn)行可行性的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建攜帶粘附域的腳手架蛋白基因和攜帶錨定域的纖維素酶基因，表達(dá)純化后在體外組裝成期望的多酶復(fù)合體。采用重組的腳手架蛋白可以將攜帶有對(duì)應(yīng)的錨定域的纖維素酶整合入纖維素酶多酶復(fù)合體，利用這一方法Fierobe等[10,22]設(shè)計(jì)了一系列含有兩種粘附域的腳手架蛋白，在體外組裝了75種含兩種纖維素酶的雙酶復(fù)合體。除了利用來(lái)源于自然界多酶復(fù)合體中的纖維素酶進(jìn)行人工設(shè)計(jì)型纖維素酶多酶復(fù)合體的組裝，一些游離纖維素酶也可以通過(guò)基因工程方法用于纖維素酶多酶復(fù)合體的構(gòu)建。來(lái)源于C.thermocellum，Thermobifidafusca和Neocallimastixpatriciarum的游離纖維素酶通過(guò)嫁接錨定域的方法與人工設(shè)計(jì)的腳手架蛋白成功的組裝了纖維素酶多酶復(fù)合體[30-32]。

在體外設(shè)計(jì)型的纖維素酶多酶復(fù)合體中，三酶復(fù)合體的協(xié)同作用遠(yuǎn)大于雙酶復(fù)合體。利用來(lái)源于Clostridiumcellulolyticum的纖維素內(nèi)切酶和外切酶以及C.thermocellum的木聚糖酶構(gòu)建的三酶復(fù)合體對(duì)木質(zhì)纖維素的降解效率是只含兩種纖維素酶的雙酶復(fù)合體的6倍[10]。即使將三種自由酶混合，其作用效果也只有三酶復(fù)合體的1/4。利用T.fusca的木聚糖酶(Xyn11A 和 Xyn10B)和纖維素酶Cel5A構(gòu)建的三酶酶復(fù)合體分解麥秸木質(zhì)纖維的試驗(yàn)中也表現(xiàn)了相似的協(xié)同作用[32]。Cha等[33]比較了Clostridiumcellulovorans的多酶復(fù)合體上含有1、2和4個(gè)粘附域時(shí)的纖維素酶的比活力，發(fā)現(xiàn)隨粘附域數(shù)量的增大，比活力依次為游離酶的1.2、1.3和1.8倍。Mora?s等[34]將來(lái)源于Thermobifidafusca的四種游離木聚糖酶 (Xyn10A, Xyn10B, Xyn11A和 Xyl43A) 通過(guò)DNA重組分別嵌合4種不同的type I 錨定域(分別來(lái)源于R.flavefaciens，C.thermocellum，A.cellulolyticus和B.cellulosolvens)，得到的4種重組的木聚糖酶。同時(shí)設(shè)計(jì)構(gòu)建含4種相應(yīng)粘附域的腳手架蛋白，組裝成多酶復(fù)合體。這種4組分的設(shè)計(jì)型纖維素酶多酶復(fù)合體的降解效率提高了25%。該研究小組進(jìn)一步用纖維素酶(Cel48A 和Cel5A )和木聚糖酶(Xyn10A和Xyn10B)構(gòu)建多酶復(fù)合體，其對(duì)秸稈纖維的降解是游離混合酶的2.6倍，4組分多酶復(fù)合體的效率是兩種雙酶復(fù)合體混合物的2倍[5]。采用同樣的設(shè)計(jì)型多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，6組分的纖維素酶多酶復(fù)合體(含Xyn10A, Xyn10B, Xyn11A，Xyl43A，Cel48A 和Cel5A)對(duì)未處理的秸稈的降解是混合酶的1.6倍，同時(shí)比來(lái)源于Clostridiumthermocellum的天然纖維素酶多酶復(fù)合體的效率提高33%～42%[35]?？梢?jiàn)，設(shè)計(jì)型纖維素酶多酶復(fù)合體可以對(duì)不同酶系的木質(zhì)纖維素酶進(jìn)行組合，增加協(xié)同作用，大幅度的提高木質(zhì)纖維素的降解。

然而，體外構(gòu)建的設(shè)計(jì)型纖維素酶多酶復(fù)合體是通過(guò)分別表達(dá)、純化腳手架蛋白和纖維素酶等組分，然后在體外組裝成多酶復(fù)合體，生產(chǎn)成本高，無(wú)法在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)在宿主細(xì)菌中高效表達(dá)重組腳手架蛋白和各個(gè)木質(zhì)纖維素酶，直接組裝多酶復(fù)合體，對(duì)木質(zhì)纖維高效降解具有重要意義。最近，Wen等[36]和Fan等[37]在酵母中實(shí)現(xiàn)了雙酶和三酶復(fù)合體表達(dá)，其中三酶復(fù)合體的活性高出約8.8倍。

纖維素酶多酶復(fù)合體為提高木質(zhì)纖維素的有效降解提供了新的策略，最近Resch等[38]采用真菌的自由酶和纖維素纖維素酶多酶復(fù)合體協(xié)同降解預(yù)處理的秸稈，自由酶和多酶復(fù)合體展現(xiàn)了顯著的協(xié)同降解效果。

5 結(jié) 語(yǔ)

木質(zhì)纖維素的巨大存量和飼料資源緊張的矛盾，使得有效降解木質(zhì)纖維素成為現(xiàn)代畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。隨著纖維素酶的深入研究，多酶系及多酶復(fù)合體的協(xié)同作用為有效降解木質(zhì)纖維素提供了有效的方法。結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)獲得高效協(xié)同降解作用的多酶復(fù)合體，結(jié)合木質(zhì)纖維素降解特點(diǎn)得到不同酶系的組合方案是解決木質(zhì)纖維素利用問(wèn)題的關(guān)鍵有效技術(shù)思路。

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