劉洪強(qiáng)，吳德峰，陳吉龍

(1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，福建 福州 350014； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002；3.中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，北京100101)

流感病毒(Influenza virus, IFV)能引起急性呼吸道疾病，是嚴(yán)重危害人畜健康的一種傳染疾病。在世界范圍廣泛存在，每年約有15%～20%的人群被流感病毒感染，最近一次流感病毒疫情是2009年爆發(fā)的甲型流感病毒H1N1，此次疫情全球共確診病例達(dá)到1311522人，其中死亡14142人。流感病毒的大流行給人類社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究流感病毒的致病機(jī)制及其分子生物學(xué)特性，對(duì)治療和預(yù)防流感病毒有重大意義[1-2]。

在流感病毒的研究過程中，合理動(dòng)物模型的建立對(duì)于研究流感病毒和宿主相互作用的致病機(jī)制非常重要。通過模型動(dòng)物可以評(píng)價(jià)抗病毒藥物及疫苗抗流感病毒的效果及其本身的安全性。動(dòng)物模型在選擇上需要遵守幾個(gè)原則，即相似性、可重復(fù)性、可靠性、生物安全性及易行性和經(jīng)濟(jì)性[3-6]。當(dāng)前用于流感病毒研究的動(dòng)物有：雪貂、小鼠、金黃倉(cāng)鼠、棉鼠及非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(食蟹猴和豚尾猴等)等?？紤]到經(jīng)濟(jì)，來源及生物安全等因素，現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室常用的流感動(dòng)物模型首選的是小鼠模型[7-12]。

1 材料和方法

1.1 材 料

流感病毒株為A/WSN/33(H1N1)，由中科院微生物研究所試驗(yàn)室經(jīng)12質(zhì)粒反向重組包裝而得。細(xì)胞株為MDCK細(xì)胞；布氏田鼠由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物研究所提供；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通試驗(yàn)動(dòng)物；

1.2 儀器設(shè)備與試劑

儀器設(shè)備與試劑均由中科院微生物所提供。

1.3 試驗(yàn)方法

布氏田鼠麻醉后,根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算LD50的10倍量的A/WSN/33(H1N1)病毒通過滴鼻的接種方式,對(duì)布氏田鼠進(jìn)行攻毒。對(duì)照組則采用雞胚尿囊液，其它步驟與攻毒組一樣。

1.4 臨床觀察及測(cè)量指標(biāo)

參照其它小鼠模型觀察和測(cè)量的指標(biāo)進(jìn)行；以攻毒當(dāng)天為開始，每隔24 h觀測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。

1.5 取材及固定

小鼠死亡后及時(shí)尸檢取材，尸檢后檢查其臟器的組織病理學(xué)上的變化并及時(shí)記錄；臟器用PBS沖洗后，一部分臟器組織用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行充分固定后，進(jìn)行HE染色等試驗(yàn)；另一部分臟器組織取出后立即用液氮速凍，放置超低溫冰箱保存。

1.5.1 MDCK細(xì)胞分離 將病死小鼠肺臟反復(fù)凍融后(目的使組織細(xì)胞中的病毒顆粒充分釋放出來)，每個(gè)肺臟加1 mL DMEM培養(yǎng)液用組織勻漿器充分研磨后3 000 rpm離心5 min，取上清，加入1/5體積的雙抗(青霉素、鏈霉素各1000 IU/mL)4 ℃過夜。次日4 ℃ 10 000 rpm離心10 min后取上清，稀釋10倍后加入100 μL/孔MDCK單層細(xì)胞，連續(xù)72 h觀察細(xì)胞病變。

1.5.2 病毒雞胚尿囊腔分離[13]將上述對(duì)臟器組織分離的病毒，按0.1 mL/胚的劑量尿囊腔途徑接種于9～11日齡SPF雞胚，其接種方法同試驗(yàn)一。

收獲的雞胚尿囊液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)臟器組織擴(kuò)增的HA效價(jià)。對(duì)首次病毒分離血凝結(jié)果呈陰性的樣品繼續(xù)傳代兩次，若用HA試驗(yàn)仍不能檢測(cè)到紅細(xì)胞的凝集，則可以被認(rèn)為此臟器的病毒分離為陰性。

1.6 RT-PCR檢測(cè):

1.6.1 PCR引物的合成: Forward primer: GCGTCGACGCCACCATGGGGAAGGCAAAA-CTACTGGTCCT Reverse primer: TCAATTGCTCCCTCAGTTCC

1.6.2 RNA的提取 RNA的提取按天根公司TRZOL說明書進(jìn)行，然后取3 uL電泳檢驗(yàn)RNA。將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于PCR試驗(yàn)，分析臟器組織中病毒HA基因的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄采用購(gòu)于Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行。然后用反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行PCR，以檢測(cè)臟器組織中流感病毒HA基因的存在情況。

1.7 評(píng)價(jià)指標(biāo)

流感病毒感染布氏田鼠模型的建立前提條件即為布氏田鼠是否對(duì)A/WSN/33(H1N1)流感病毒株具有敏感性及復(fù)制性，在此前提下，進(jìn)一步建立穩(wěn)定的流感病毒感染布氏田鼠的動(dòng)物模型及模型的指標(biāo)。流感病毒對(duì)布氏田鼠的易感性及流感病毒的布氏田鼠動(dòng)物模型建立的評(píng)價(jià)指標(biāo)如下：(1)體質(zhì)量變化：接種的當(dāng)天記為第一天，每24 h測(cè)量體重一次，并記錄；(2)臨床癥狀的變化：按照流感病毒的其它小鼠動(dòng)物模型的感染癥狀進(jìn)行參考，觀察感染布氏田鼠的相應(yīng)癥狀，包括：精神狀態(tài)、毛色、飲食、行為活動(dòng)及呼吸情況等；(3)肺臟指數(shù)：為小鼠肺臟質(zhì)量比小鼠體質(zhì)量；(4)病理變化：包括肺臟、肝臟等臟器的病理變化及其相應(yīng)的病理組織學(xué)變化；(5)病毒的分離：采取感染小鼠的組織進(jìn)行病毒的分離，紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定；(6)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：檢測(cè)感染小鼠中流感病毒顆粒；

2 結(jié)果與分析

2.1 A/WSN/33(H1N1)流感病毒對(duì)布什田鼠的感染性測(cè)定

試驗(yàn)將病毒以不同的稀釋度通過滴鼻接種的方式，對(duì)布氏田鼠攻毒，試驗(yàn)共分為6個(gè)組，其中一個(gè)組為雞胚尿囊液的對(duì)照組，另外5組布氏田鼠則分別感染病毒稀釋倍數(shù)為10-1～10-5。布氏田鼠攻毒1 d后，攻毒組即出現(xiàn)較明顯的臨床癥狀，如體重下降，精神沉郁等，后期體質(zhì)量下降嚴(yán)重，反應(yīng)性降低，嗜睡，呼吸困難等，對(duì)照組小鼠沒有任何臨床癥狀，體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，呼吸良好，精神狀態(tài)良好，采食性及飲水性都正常。結(jié)果表明，攻毒的病毒其稀釋度越低則對(duì)布氏田鼠的致病力越強(qiáng)，符合正常感染規(guī)律。

A/WSN/33(H1N1)流感病毒感染布什田鼠后，其潛伏期為1～3 d，病程為2～7 d，感染7 d后，小鼠體質(zhì)量不再下降的小鼠癥狀逐漸減輕。通過Reed-Muench法計(jì)算病毒的LD50為10-4.5/0.10 mL(見表1)。

通過以上試驗(yàn)的結(jié)果可以表明，布氏田鼠對(duì)A/WSN/33(H1N1)流感病毒易感性很強(qiáng)，而且感染后能夠表現(xiàn)出比較明顯的臨床癥狀及與人相似的癥狀表現(xiàn)，因此，從易感性方面及臨床癥狀表現(xiàn)等方面，布氏田鼠可以作為流感病毒感染的動(dòng)物模型備選動(dòng)物。對(duì)于其模型的建立，需要進(jìn)一步檢測(cè)和評(píng)價(jià)布氏田鼠作為流感病毒感染模型的模型標(biāo)準(zhǔn)。

表1 布氏田鼠感染流感病毒后死亡情況Table 1 Infected result of mice infected A/WSN/33(H1N1)virus

2.2 布氏田鼠模型的建立結(jié)果

2.2.1 臨床癥狀與體質(zhì)量變化 試驗(yàn)組攻毒后，感染小鼠1～2 d發(fā)病，前期表現(xiàn)出精神沉郁、采食量減少、反應(yīng)性降低，眼半閉，聚堆等，感染后期則出現(xiàn)呼吸困難、嗜睡、閉目、被毛逆立、縮頭弓背、消瘦、死亡等臨床癥狀，恢復(fù)期從7～8 d開始，臨床癥狀開始減輕，精神狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，反應(yīng)性及活動(dòng)性增強(qiáng)，采食量逐漸恢復(fù)，最后逐漸恢復(fù)正常。對(duì)照組小鼠，始終精神狀態(tài)良好，采食量及反應(yīng)性都正常，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。

試驗(yàn)布氏田鼠在攻毒前，其體質(zhì)量都表現(xiàn)正常，試驗(yàn)組和對(duì)照組無明顯區(qū)別。攻毒后，對(duì)照組布氏田鼠體質(zhì)量繼續(xù)逐日上升，試驗(yàn)組小鼠攻毒后第一天就出現(xiàn)體質(zhì)量的下降，7～8 d后體質(zhì)量不再下降的小鼠，逐漸恢復(fù)正常(見圖2)。

2.2.2 組織病理學(xué)變化結(jié)果 死亡小鼠剖檢可見感染小鼠肺臟有明顯的病理變化，肺臟淤血、充血和水腫，肺臟體積有明顯增大，肺臟組織局部有輕度實(shí)變。肝臟、腎臟有輕微淤血，腫大不明顯，其它臟器組織的可見病理變化不明顯。對(duì)照組布氏田鼠的剖檢結(jié)果顯示基本正常。

肺臟鏡下病理變化：肺間質(zhì)間有明顯的慢性炎癥，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)其中，間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡上皮細(xì)胞壞死脫落，肺泡腔中大量的紅細(xì)胞及炎性粒細(xì)胞充盈，肺泡膈增厚，炎性區(qū)肺泡消失，(見圖3)。雞胚尿囊液對(duì)照組未見病理改變。

圖1 試驗(yàn)各組體質(zhì)量下降變化情況Fig. 1 Infected result of mice infected A/WSN/33(H1N1)virus

圖2布氏田鼠感染A/WSN/33(H1N1)后體質(zhì)量變化Fig. 2 Infected result of mice infected A/WSN/33(H1N1)virus

圖3 流感病毒感染布氏田鼠的肺組織病理圖片F(xiàn)ig. 3 HE pathological section of mice1.正常肺臟組織HE染色(10×20)；2-6.感染流感病毒死亡小鼠的肺臟組織HE染色1.No abnormality is seen in Lung of the mice(10×20)；2-6.The histological appearance of the lung

肝臟鏡下病理變化：肝臟變化不明顯，有的肝臟出血、淤血，肝竇充血，有部分出現(xiàn)肝脂肪性變性(見圖4)。雞胚尿囊液對(duì)照組未見病理改變。

腎臟組織鏡下病理變化：部分腎小管的上皮細(xì)胞脫落、壞死，腎髓質(zhì)間質(zhì)局部淤血等(見圖5)。雞胚尿囊液對(duì)照組未見病理改變。

另外，氣管的固有層和肌層出血，局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。其它的臟器組織未見明顯的病理變化。

圖4 流感病毒感染布氏田鼠的肝臟組織病理圖片(HE)Fig. 4 HE pathological section of mice

圖5 流感病毒感染布氏田鼠的腎臟組織病理圖片(HE10×20)Fig. 5 HE pathological section of mice

2.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 用A/WSN/33(H1N1)流感病毒NP蛋白的多克隆抗體和生物素標(biāo)記的山羊抗兔的二抗做死亡小鼠的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，其陽(yáng)性結(jié)果在組織細(xì)胞中可見棕黃色的顆粒，陰性結(jié)果則相反。結(jié)果表明在肺臟的上皮細(xì)胞中可以看到棕黃色的陽(yáng)性顆粒，證明流感病毒在布氏田鼠的肺臟中存在(見圖6)。

2.2.4 流感病毒的分離 雞胚接種分離流感病毒結(jié)果死亡布氏田鼠肺臟上清接種SPF雞胚分離流感病毒，然后通過紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)流感病毒的存在，結(jié)果為陰性的，連續(xù)傳三代雞胚，如還沒有則為陰性。在小鼠的肺臟及腎臟中分離的病毒經(jīng)雞胚傳代后，能夠檢測(cè)到紅細(xì)胞凝集，其它組織則沒有出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

2.2.5 臟器RT-PCR結(jié)果 死亡的布氏田鼠各臟器組織經(jīng)反復(fù)凍融充分研磨，在避免RNA降解的前提下，提取各臟器組織總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA后，用A/WSN/33(H5N1)流感病毒的HA基因中某一段序列設(shè)計(jì)引物，其擴(kuò)增目的基因的片段為370 bp，通過PCR反應(yīng)特異性擴(kuò)增WSN病毒的 這一段HA基因片段。

RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明，在小鼠的肺臟、肝臟和腎臟中檢測(cè)到流感病毒的相應(yīng)大小的HA基因片段的存在。在其它臟器組織中則沒有檢測(cè)到HA片段基因。(如圖7)

圖6 WSN/33(H1N1)感染布氏田鼠NP抗體免疫組化(10×40)Fig.6 Immunohistochemistry SP of Mice lung

圖7 小鼠臟器組織PCR擴(kuò)增HA基因片段電泳結(jié)果Fig.7 Results of RT-PCR on organs of mice1.Marker;2.陰性對(duì)照；3.肝臟；4.肺臟；5.腎臟1.Marker;2.Negative;3.Liver;4.Lung;5.Kidney

3 討 論

3.1 建立流感動(dòng)物模型的臨床價(jià)值

流感病毒感染人后能夠?qū)е聫膩喤R床感染到嚴(yán)重的病毒性肺炎為主的呼吸系統(tǒng)疾病，并可導(dǎo)致死亡。流感病毒動(dòng)物模型對(duì)于弄清病毒與宿主之間相互作用而致病的機(jī)制是非常必要的。另外模型的一個(gè)重要作用是可以用于一些抗流感病毒藥物及疫苗效果的臨床前期的評(píng)估?，F(xiàn)在用于流感動(dòng)物模型的對(duì)象主要有雪貂、小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠等。鼠類作為流感動(dòng)物模型有很多優(yōu)點(diǎn)，包括遺傳背景比較簡(jiǎn)單，便于飼養(yǎng)及比較廉價(jià)，感染癥狀與人比較相似，有比較明顯的臨床癥狀，便于對(duì)于疾病的評(píng)價(jià)。許多人流感病毒不能直接感染小鼠，需要在小鼠內(nèi)連續(xù)傳代后獲得其相應(yīng)的鼠適應(yīng)株后，才具有較好的感染效果。小鼠感染后會(huì)呈現(xiàn)一定的臨床癥狀，包括體質(zhì)量下降、精神沉郁、呼吸急促等，剖檢一般可見以肺炎為主的肺臟病理變化，而其它臟器相對(duì)不明顯。本試驗(yàn)主要目的是通過參考其它流感病毒動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)來建立流感病毒感染布氏田鼠的模型并建立其相應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以期下一步能夠?yàn)樵u(píng)估自然條件下流感病毒的致病機(jī)制和宿主的免疫機(jī)制打下基礎(chǔ)，從而為流感病毒的預(yù)防和控制提供技術(shù)支撐。

布氏田鼠對(duì)流感病毒的易感性研究結(jié)果表明，流感病毒可以感染布氏田鼠，并且布氏田鼠對(duì)流感病毒非常敏感，感染后布氏田鼠表現(xiàn)出極高的感染率和死亡率，證明布氏田鼠可以用于下一步的流感病毒動(dòng)物模型的研究。

3.2 流感病毒感染布氏田鼠的臨床癥狀

流感病毒經(jīng)滴鼻的接種方式感染布氏田鼠后，其潛伏期短，1～2 d即發(fā)病，前期表現(xiàn)體質(zhì)量降低、精神沉郁、采食量減少、反應(yīng)性降低，眼半閉，聚堆等，感染后期則出現(xiàn)呼吸困難、嗜睡、閉目、被毛逆立、縮頭弓背、消瘦、死亡等臨床癥狀，剖檢可見肺臟腫大充血、淤血，肺臟組織局部有輕度實(shí)變。肝臟、腎臟有輕微淤血，腫大不明顯，其它臟器組織可見病理變化不明顯。組織病理學(xué)主要為肺臟的病變，以間質(zhì)性肺炎為主，可見肺泡中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)其中，間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡上皮細(xì)胞壞死脫落，肺泡腔中大量的紅細(xì)胞及炎性粒細(xì)胞充盈，肺泡間膈增厚，炎性區(qū)肺泡消失。其它臟器則不明顯。

恢復(fù)期從7～8 d開始，臨床癥狀開始減輕，精神狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，反應(yīng)性及活動(dòng)性增強(qiáng)，采食量逐漸恢復(fù)，體質(zhì)量也開始恢復(fù)，最后逐漸恢復(fù)正常。

3.3 布氏田鼠體質(zhì)量的變化

試驗(yàn)結(jié)果分析表明，流感病毒感染布氏田鼠后可以導(dǎo)致其體質(zhì)量的下降，這與其它流感病毒感染小鼠模型指標(biāo)相一致。而且體質(zhì)量的變化可以用于對(duì)于整個(gè)疾病過程的評(píng)估，前期癥狀中體質(zhì)量的降低是評(píng)價(jià)小鼠感染的指標(biāo)之一，后期對(duì)于疾病的發(fā)展也是一個(gè)重要的參考，如果體質(zhì)量持續(xù)下降，最終小鼠可能死亡。如果7～8 d后，體質(zhì)量不再下降并逐漸恢復(fù)，則小鼠最終轉(zhuǎn)歸。體質(zhì)量的變化被認(rèn)為是流感病毒小鼠模型建立成功的重要指標(biāo)之一。

3.4 病毒的分離及其檢測(cè)指標(biāo)

通過對(duì)感染流感病毒的布氏田鼠的臟器中病毒的分離結(jié)果表明，肺臟的上清接種MDCK細(xì)胞后，可見明顯的細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落等細(xì)胞病變，其它臟器通過SPF雞胚擴(kuò)增后，只有肝臟中檢測(cè)到了有血凝。

流感病毒感染布氏田鼠能夠出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀并且死亡，這種結(jié)果是流感病毒與宿主布氏田鼠之間共同作用產(chǎn)生的。說明流感病毒可以在布氏田鼠的肺臟中大量存在和復(fù)制，因而引起了肺臟的病理變化，是布氏田鼠發(fā)病、死亡的重要致病機(jī)制。如果在發(fā)病期，小鼠獲得了較強(qiáng)的免疫力，并能夠清除病毒，則小鼠會(huì)逐步恢復(fù)至正常。

本次試驗(yàn)采用了RT-PCR及免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)了死亡布氏田鼠中流感病毒存在情況表明，在其肺臟中都檢測(cè)到了流感病毒的存在，說明流感病毒感染布氏田鼠的主要靶器官為肺臟，與其它流感病毒動(dòng)物模型相一致。

綜上所述，通過滴鼻的接種方式可以使布氏田鼠人為感染流感病毒，并且布氏田鼠表現(xiàn)出較強(qiáng)的易感性和致病性，感染后可引起與人相似的臨床特征及肺部的病理變化。并且其發(fā)病規(guī)律與人也極為相似，對(duì)于模型的檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果明確可靠，表明布氏田鼠可以作為流感病毒感染的良好動(dòng)物模型，并且獲得了穩(wěn)定的布氏田鼠模型建立的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

4 結(jié) 論

布氏田鼠可以作為一個(gè)流感病毒感染的動(dòng)物模型，試驗(yàn)成功建立了布氏田鼠的流感病毒感染模型，并通過體質(zhì)量變化、臨床癥狀和病理變化、病毒分離及病毒的檢測(cè)等方面確立了其作為流感病毒感染模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)，說明成功建立了流感病毒感染布氏田鼠的動(dòng)物模型。

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