體外擴增人NK細胞及其對白血病細胞殺傷作用的研究

蔣衛(wèi) 韓穎 吳曉松 吳慧群 施菊妹

●論 著

體外擴增人NK細胞及其對白血病細胞殺傷作用的研究

蔣衛(wèi) 韓穎 吳曉松 吳慧群 施菊妹

目的 通過體外擴增人NK細胞的方法，探討擴增后NK細胞對K562和HL60白血病細胞株的體外殺傷作用及機制。方法抽取5例健康志愿者外周血，分離單個核細胞（PBMC），與基因修飾K562細胞共同培養(yǎng)，采用流式細胞儀檢測NK細胞的表型，鉻51釋放法測定NK細胞對白血病細胞的殺傷率。結果基因修飾K562細胞在體外刺激NK細胞擴增202倍；擴增后NK細胞對白血病細胞K562、HL60的殺傷率分別為77.1%、61.2%（效/靶比為8∶1），擴增前NK細胞對K562、HL60殺傷率分別為39.0%、35.4%；擴增后NK細胞表面活化受體NKG2D、NKp30和NKp44表達增強；這些活化受體特異抗體能部分抑制擴增后NK細胞的抗白血病作用。結論基因修飾K562細胞刺激NK細胞有效擴增，擴增后NK細胞殺傷白血病細胞作用明顯增強，擴增后NK細胞表面部分活化受體上調(diào)可能為擴增后NK細胞抑制白血病作用增強的分子機制，NK細胞治療在白血病中有潛在的應用前景。

自然殺傷細胞 擴增 白血病

【 Abstract】 ObjectiveThis study is to investigate the method for expansion of human NK cells in vitro.We also tested the role of expanded NK cells in killing of K562 and HL60 leukemia cells and its mechanism.MethodsPeripheral blood mononuclear cells (PBMC)were isolated from peripheral blood donored by 5 healthy individuals.PBMC were co-cultured with irradiated genetic modified K562 cell transfectants for 14 days.The cultures were then analyzed for fold expansion and cytotoxicity by flow cytometry and 51Cr-release assays.ResultsThis co-culture system could effectively expand NK cells (by a mean of 202 folds).The expanded NK cells killed K562 and HL60 cells avidly as shown by 51Cr-release assays.The mean cytotoxic rate of expanded NK cells against leukemia cells was 77.1%(K562),61.2%(HL60)at an E∶T ratio of 8∶1 compared to 39.0%(K562), 35.4% (HL60)of non-expanded NK cells,respectively.There was no killing of auto-and allo-PBMC.We observed stronger expression of activating receptor NKG2D,NKp30,NKp44 in expanded NK cells than in non-expanded NK cells.These specific antibodies could partly inhibited the enhanced lysis of K562 cells by expanded NK cells.ConclusionK562 transfectants can stimulate vigorous expansion of NK cells,and the expanded NK cells had an enhanced cytotoxic effect against leukemia cells. Up-regulation of activating receptors on expanded NK cells may be the mechanisms of enhanced killing of leukemia cells by expanded NK cells.NK cell therapy may be used for immunotherapy of leukemia.

急性白血病預后差，絕大部分患者治療效果不滿意[1]。近年來NK細胞在腫瘤過繼免疫治療方面的作用倍受關注，在白血病治療中取得了顯著的療效[2-3]。早在2002年Ruggeri等[4]報道的臨床研究結果，57例急性髓系白血?。ˋML）患者接受單倍體相合去T細胞移植后，其中20例有供者NK細胞抑制性受體和患者白血病細胞配體（L）不相合的患者經(jīng)隨訪，5年后復發(fā)率為0，然而其對照組相合的患者復發(fā)率為75%，表明供者NK細胞抑制性受體與腫瘤細胞表面配體不合的NK細胞在患者體內(nèi)發(fā)揮了有效的抗白血病作用。但限制這些過繼性免疫療法的一個重要因素是無法獲得足量的高活性NK細胞。目前如何擴增NK細胞和如何調(diào)控NK細胞功能，以增強NK細胞的抗腫瘤效應方面的研究已經(jīng)成為熱點[5-6]。本研究探討了體外擴增健康人NK細胞的方法，觀察擴增后NK細胞對白血病細胞株的殺傷作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株和試劑 RPMI 1640細胞培養(yǎng)液為美國Gibco公司產(chǎn)品。熒光標記抗體CD3、CD14、CD19、CD33、CD14、CD56、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR3DL1均為美國BD公司產(chǎn)品。anti-NKG2D、anti-NKp30、anti-NKp44、anti-NKp46抗體購自美國BD公司。CD3、CD56磁珠購自德國美天旎公司。基因修飾后表達膜結合白介素（IL）-15和4-1BB（CD137）配體（L）的K562細胞株（K562-mb15-41BBL）為同濟大學附屬第十人民醫(yī)院實驗室保留細胞，K562和HL60白血病細胞株購自美國Type Culture Collection（Manassas,VA）。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞（PBMC）分離 抽取5例健康志愿者外周靜脈血50 ml，收集于肝素抗凝管中，用淋巴細胞分離液以密度梯度離心法分離外周血PBMC，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。

1.2.2 NK細胞擴增 PBMC與輻照后K562-mb15-41BBL（輻照劑量為100Gy）按1∶1.5的比例混合培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含300 U/ml IL-2，在共培養(yǎng)的第7天，再以輻照后的細胞株刺激NK細胞擴增，擴增時同樣條件復種3孔，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d半量換液，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并使得IL-2的終濃度為300 U/ml。于培養(yǎng)前和培養(yǎng)第14天采用錐蟲藍染色法計算總活細胞數(shù)，總活細胞數(shù)除以初始細胞數(shù)，求出實際擴增倍數(shù)。

1.2.3 流式細胞儀分析 取待標記的細胞1×106，分別加入10μl的熒光抗體，室溫避光孵育20min后，PBS洗滌3次，通過流式細胞儀檢測細胞表面分子的表達情況。

1.2.4 4h-鉻（Cr）51釋放法 采用Cr51釋放試驗測定NK細胞殺傷率，用Cr51標記靶細胞1.5 h，培養(yǎng)液洗滌靶細胞3次。運用mini磁性細胞分選器（MACS）免疫磁珠分選，純化NK細胞，NK細胞的純度約95%。NK細胞功能阻斷實驗，采用單獨或聯(lián)合應用針對NK細胞表面受體（NKG2D、NKp30和NKp44）的特異抗體阻斷其表面表達的受體，觀察阻斷這些受體后對NK細胞殺傷率的影響。NK細胞與靶細胞按一定比例（見結果部分）混合于96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)（37℃,5%CO2）4 h，每個效/靶比均設3個平行孔，收集上清液。應用γ計數(shù)儀測定上清液中放射量（以cpm值表示）。特異性殺傷率（%）=（樣本cpm值-背景cpm值）/最大釋放cpm值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，擴增前后比較采用配對t檢驗，每組數(shù)據(jù)至少重復3次實驗。

2 結果

2.1 健康人外周血單個核細胞中NK細胞的擴增情況 通過流式細胞儀檢測，混合培養(yǎng)后NK細胞（CD3-CD56+）數(shù)量較混合培養(yǎng)前擴增了約202倍（范圍：67～366）；擴增后的細胞中NK細胞顯著富集，擴增前（第0天）NK細胞平均含量12%（范圍：4.8%～20.1%）；擴增后（第14天）NK細胞平均含量87.1%（范圍：80.1%～94.3%），擴增后NK細胞含量與擴增前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，NKT細胞（CD3+CD56+）平均擴增了3.5倍（范圍：0.4～6.8，P＞0.05），但擴增后NKT細胞較擴增前無顯著的富集（第0天平均5.0%，范圍：0.8%～8.4%；第14天平均5.2%，范圍：3.4%～6.4%）。與NK細胞、NKT細胞對照，T細胞（CD3+CD56-）含量明顯減少（第0天平均60.9%，范圍：48.4%～66.1%；第14天平均5.2%，范圍：0.9%～11.3%）?；旌吓囵B(yǎng)體系主要細胞成分的含量見表1；NK細胞和NKT細胞擴增前和擴增后的分布情況見圖1。

2.2 體外擴增前后NK細胞對白血病細胞殺傷作用比較 在NK細胞與白血病細胞的比例為8∶1時，擴增后NK細胞對K562細胞株的殺傷率（平均77.1%，范圍：70.1%～89.2%）顯著高于擴增前NK細胞對該細胞株的殺傷率（平均39.0%，范圍：32.9%～48.6%，P＜0.05）。在NK細胞與HL60細胞的比例為8∶1時，擴增后NK細胞對HL60細胞株的殺傷率（平均61.2%，范圍：55.6%～70.7%）顯著高于擴增前NK細胞對HL60細胞的殺傷率（平均35.4%，范圍：33.4%～38.6%，P＜0.05）。擴增后NK細胞對自體和異體PBMC幾乎無細胞毒性作用，平均殺死率＜5%。5例健康志愿者擴增前和擴增后NK細胞對K562、HL60細胞的殺傷率見圖2。結果提示擴增后NK細胞對白血病細胞株的殺傷作用顯著增強。

表1 擴增后培養(yǎng)體系中主要細胞成分

圖1 擴增前和擴增后NK細胞和NKT細胞的分布

圖2 5例志愿者擴增前和擴增后的NK細胞對K562、HL60細胞的殺傷率

2.3 擴增后NK細胞表面活化性受體表達情況 擴增后NK細胞表面殺傷細胞活化受體例如NKG2D、NKp30和NKp44表達增強，NKp46活化分子無顯著變化。但是，NK細胞表面的主要抑制性受體如KIR2DL1、KIR2DL2/L3和KIR3DL1表達無明顯變化，提示擴增后NK細胞表面的NKG2D、NKp30和NKp44活化性受體表達增強，可能使得擴增后NK細胞具有較強的抑制白血病作用。擴增前和擴增后NK細胞表面的主要活化性受體和抑制性受體表達情況見圖3。

2.4 擴增后NK細胞抗白血病作用的變化 anti-NKG2D、anti-NKp30、anti-NKp44、anti-NKp46和anti-NKG2D、anti-NKp30、anti-NKp44的3種抗體混合液對擴增后NK細胞殺傷K562細胞有阻斷作用，NK細胞殺傷功能的平均抑制百分率分別為36.2%（anti-NKG2D）、25.4%（anti-NKp30）、23.8%（anti-NKp44）、3.9%（anti-NKp46）和68.3%（anti-NKG2D和anti-NKp30和anti-NKp44）（n=3）。

3 討論

AMC的預后較差，尤其是對不耐受大劑量化療藥物或不適合移植的患者，所以迫切需要新的治療方法來緩解患者病情。研究表明，NK細胞介導的移植物抗腫瘤（GVT）作用可以增加抗腫瘤作用；NK細胞對于樹突狀細胞的清除可以阻斷移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生；NK細胞可以通過去除受者的T淋巴細胞以利于移植物的植入，減少了骨髓毒性藥物的用量，縮短了中性粒細胞減少的時間，NK細胞治療在清除AML細胞和allo-HSCT中有重要作用[4]，有望成為緩解AML新的治療手段，具有較好的臨床應用前景[7]。Miller等[8]給予未經(jīng)移植19例不良預后的AML患者同種異體NK細胞及IL-2的聯(lián)合輸注，結果顯示，同種異體NK細胞輸注有較好的耐受性，患者體內(nèi)的供者NK細胞有擴增，且沒有發(fā)生GVHD，其中5例（26%）獲得了形態(tài)學緩解，進一步研究患者與供者的殺傷細胞抑制性受體-配體相容性發(fā)現(xiàn)，5例形態(tài)學緩解患者中4例具有殺傷細胞抑制性受體-配體不相容性，在這4例患者中3例獲得完全緩解。在高危AML和兒童急性淋巴細胞白血病中，殺傷細胞抑制受體-配體不相容的同種異體NK細胞能降低白血病的復發(fā)率，顯著提高患者的無事件生存率[9]，這說明選擇殺傷細胞抑制受體-配體不相容的供者可有助于在未來的臨床試驗中獲得成功，同種異體NK細胞可以持續(xù)存在并可在體內(nèi)擴增[8]，可以單獨或聯(lián)合造血干細胞移植用于治療某些血液系統(tǒng)腫瘤。

圖3 擴增前和擴增后NK細胞表面的受體表達情況

雖然NK細胞治療取得了可喜的成績，但由于NK細胞來源少、抗腫瘤活性低和增殖力低下等因素制約了NK細胞免疫治療的廣泛應用[10]。我們運用基因修飾后表達膜結合IL-15和4-1BB（CD137）配體的K562細胞刺激健康人PBMC中未經(jīng)富集的NK細胞，能刺激NK細胞擴增約202倍，擴增后培養(yǎng)體系中NK細胞含量87%，與擴增前NK細胞含量12%相比較，NK細胞有明顯富集。近年來國內(nèi)外對體外擴增NK細胞進行了研究，Voskens等[11]報道，運用K562-mb15-41BBL刺激NK細胞擴增約165倍，與我們的結果相似。

NK細胞表面有兩類不同功能受體：即殺傷細胞活化受體和殺傷細胞抑制受體。NK細胞對髓系白血病細胞的殺傷主要通過以下機制：一種是通過NK細胞表面表達的受體DNAM-1去識別相應的配體如PVR（CD155）和Nectin-2（CD112），從而激活NK細胞；另一種是通過NK細胞上KIRs和靶細胞上的HLA不相容性識別并殺傷靶細胞。此外，NK細胞的細胞毒性受體（NCRs:NKp30、NKp44、NKp46）和共刺激分子也參與其抗腫瘤作用。通過鉻51NK細胞殺傷試驗，我們發(fā)現(xiàn)，效/靶比8∶1時，擴增后NK細胞對K562、HL60細胞的殺傷率分別為77.1%和61.2%，顯著高于擴增前NK細胞對K562、HL60細胞的殺傷率（K562細胞殺傷率為39.0%，HL60細胞殺傷率為35.4%）。但擴增后NK細胞對健康人自體和異體PBMC無明顯殺傷作用。流式細胞儀分析NK細胞表面受體，結果顯示NKG2D、NKp30和NKp44活化受體明顯上調(diào)，我們進一步運用特異性抗體，驗證了NKG2D、NKp30和NKp44活化受體上調(diào)可能是擴增后NK細胞抗腫瘤作用增強的主要因素。當聯(lián)合應用這些阻斷抗體時，未能完全抑制NK細胞殺傷功能，提示擴增后NK細胞表面活化受體NKG2D、NKp30和NKp44上調(diào)在擴增后NK細胞抗白血病中起重要作用，但其他活化受體的上調(diào)表達可能在抗白血病作用中也具有一定的作用。

綜上所述，基因修飾的K562細胞能刺激NK細胞擴增，擴增后NK細胞對K562和HL60白血病細胞株的殺傷作用顯著增強，擴增后NK細胞表面活化受體NKG2D、NKp30和NKp44表達增強，可能為擴增后NK細胞抑制白血病作用增強的分子機制，本研究為白血病及其他NK細胞敏感腫瘤的治療新途徑提供了實驗依據(jù)，具有潛在的臨床應用前景。

[1] Phillips G L.Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)for high-risk acute myeloid leukemia(AML)/myelodysplastic syndrome (MDS):how can we improve outcomes in the near future[J].Leuk Res,2012,36(12):1490-1495.

[2] Vey N,Bourhis J H,Boissel N,et al.A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission[J]. Blood,2012,120(22):4317-4323.

[3] Curti A,Ruggeri L,D'Addio A,et al.Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients [J].Blood,2011,118(12):3273-3279.

[4] Ruggeri L,Capanni M,Urbani E,et al.Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants[J].Science,2002,295:2097-2100.

[5] Koehl U,Brehm C,Huenecke S,et al.Clinical grade purification and expansion of NK cell products for an optimized manufacturing protocol[J].Front Oncol,2013,3:118.

[6] Lim S A,Kim T J,Lee J E,et al.Ex vivo expansion of highly cytotoxic human NK cells by cocultivation with irradiated tumor cells for adoptive immunotherapy[J].Cancer Res,2013,73(8): 2598-2607.

[7]Lichtenegger F S,Schnorfeil F M,Hiddemann W,et al.Current strategies in immunotherapy for acute myeloid leukemia[J].Immunotherapy,2013,5(1):63-78.

[8] Miller J S,Soignier Y,Panoskaltsis-Mortari A,et al.Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer[J].Blood,2005,105:3051-3057.

[9] Velardi A,Ruggeri L,Mancusi A,et al.Natural killer cell allorecognition of missing self in allogeneic hematopoietic transplantation:a tool for immunotherapy of leukemia[J].Curr Opin Immunol,2009,21:525-530.

[10] Fujisaki H,Kakuda H,Imai C,et al.Replicative potential of human natural killer cells[J].Br J Haematol,2009,145(5):606-613.

[11] Voskens C J,Watanabe R,Rollins S,et al.Ex-vivo expanded human NK cells express activating receptors that mediate cytotoxicity of allogeneic and autologous cancer cell lines by direct recognition and antibody directed cellular cytotoxicity[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:134.

（本文編輯：馬雯娜）

《浙江醫(yī)學》對作者署名的一般要求

同時具備以下3項條件者方可署名為作者：（1）參與選題和設計或資料的分析與解釋者；（2）起草或修改論文中關鍵性理論或其他主要內(nèi)容者；（3）能對編輯部的修改意見進行核修，在學術界進行答辯，并最終同意該文發(fā)表者。僅參與研究項目資金的獲得或收集資料者不能列為作者，僅對科研小組進行一般管理者也不宜列為作者。對文章中的各主要結論，均必須至少有1位作者負責。作者中如有外籍作者，應征得其同意，并在投稿時向編輯部提供相應證明材料。集體署名的文稿，在題名下列出署名單位，于文末列出整理者姓名，并須明確該文的主要負責人，在論文首頁腳注通信作者姓名、單位、郵政編碼及E-mail地址。通信作者一般只列1位，由投稿者確定。如需注明協(xié)作組成員，則于文末參考文獻前列出協(xié)作組成員的單位及姓名。作者的具體排序應在投稿前即確定，在編排過程中不應再改動，確需改動時必須出示單位證明。

本刊編輯部

Expansion of human natural killer cells with specific cytotoxicity against leukemia cells in vitro

Natural killer cells Expansion Leukemia

2013-07-24）

國家自然科學基金（81071856、30973450）、上海市浦江人才計劃（11PJ1407900）；上海市科委基金（12410705100）；同濟大學附屬第十人民醫(yī)院基金（10RD103、11SC103）

200072 上海，同濟大學附屬第十人民醫(yī)院血液科（蔣衛(wèi)、韓穎均為第一作者）

施菊妹，E-mail：shijumei@hotmail.com