李彬斐 鄭昌華 王希佳 陳亨平 張小羅

LRRK2基因G2385R突變與帕金森病相關性研究

李彬斐 鄭昌華 王希佳 陳亨平 張小羅

目的探討LRRK2基因G2385R突變與中國沿海地區(qū)漢族人群帕金森病（PD）相關性，分析LRRK2基因多態(tài)在PD發(fā)病中的作用。方法收集PD患者197例（PD組）、健康對照者202例（對照組）的臨床資料與基因組DNA。檢測PD患者G2385R基因型；測定變異攜帶者及非攜帶者DNA序列。分析G2385R基因型在PD組和對照組中分布頻率及其與性別、年齡相互作用，統(tǒng)計G2385R變異人群歸因危險度百分比。結(jié)果PD組[19例（9．64%）]患者GA基因型高于對照組[5例（2．48%）]（χ2=9．07，P＜0．01，OR=5．04，95%CI=2．16～11．78）。人群歸因危險度百分比7．82%。未發(fā)現(xiàn)AA基因型。晚發(fā)型PD患者GA基因型為9．80%，與對照組（2．23%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01，OR=4．35，95%CI=1．76～12．93）。攜帶G2385R患者與非攜帶患者臨床表型在性別、發(fā)病年齡、臨床癥狀、UPDRS評分及Hoehn-Yahr分級差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）。結(jié)論LRRK2基因G2385R變異在中國沿海地區(qū)漢族人群中與晚發(fā)性PD相關，存在不同地區(qū)差異。

帕金森病 G2385R基因型 單核苷酸

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association between G2385R polymorphisms of LRRK2 gene and Parkinson's disease(PD)．MethodsThe clinical data and peripheral blood samples were collected from 197 PD patients and 202 healthy subjects．Polymerase Chain Reaction combined with restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detected the G2385R genotypes of PD patients,the G2385R genotype was verified by the sequencing．The sex,age,clinical symptoms, UPDRS score and Hoehn-Yahr grade were compared among PD patients with different genotypes．The frequencies of genotype distribution of PD patients and healthy subjects were compared．The population attributable risk percent(PAR%)of G2385R variations was counted and the synergy with gender and age interaction was analyzed．ResultsThe genotype GA of G2385R was detected in 19 cases of PD(9．64%),while that was detected in 5 controls(2．48%)(χ2=9．07,P＜0．01,OR=5．04,95%CI:2．16～11．78) and the PAR%of 7．82%was gained．No PD patient with AA genotype was found．The genotype GA was detected in 15 cases of late-onset PD(9．80%),in the age-matched controls,there were only 4 subjects of GA genotype(2．23%)(P＜0．01,OR=4．35,95% CI:1．76～12．93)．There were no significant differences in clinical phenotypes(sex,age,clinical symptoms,UPDRS score and Hoehn-Yahr grade）between patients carrying G2385R and those not carrying．ConclusionThe G2385R variant in LRRK2 gene may be a risk factor of the late-onset Parkinson's disease in Han Chinese patients．

帕金森?。≒D）是常見神經(jīng)系統(tǒng)變性病，其病因、發(fā)病機制尚未明確。LRRK2基因突變出現(xiàn)在家族性帕金森綜合征頻率很高，其變異具有種族差異[1-2]。LRRK2基因G2385R突變主要在亞洲人群中，在新加坡、中國大陸和臺灣地區(qū)人群以及日本、韓國的獨立研究中均發(fā)現(xiàn)G2385R與PD發(fā)病相關[3]。目前在中國有關G2385R基因型與PD相關性研究報道來自上海及四川[4-5]，關于中國沿海地區(qū)人群G2385R基因型與PD發(fā)病關系鮮有報道。本文通過中國沿海地區(qū)人群LRRK2基因G2385R突變型病例對照研究，探討LRRK2基因多態(tài)在中國沿海地區(qū)漢族人群PD發(fā)病中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集溫嶺市中醫(yī)院及溫嶺市第一人民醫(yī)院2009-03—2011-10門診及住院PD患者197例為PD組（溫嶺市中醫(yī)院107例，溫嶺市第一人民醫(yī)院90例）。男117例，女80例，年齡29～81（60.3±11.5）歲，發(fā)病年齡15～82（57.1±11.4）歲。其中早發(fā)PD（發(fā)病年齡≤50歲，EOPD組）者44例，發(fā)病年齡15～50歲（43.4±6.5）歲。晚發(fā)PD（發(fā)病年齡＞50歲，LOPD組）153例，發(fā)病年齡51～82（64.8±7.4）歲。所有患者根據(jù)英國BrainBank標準確診為PD，由專人詳細記錄并核實患者的發(fā)病年齡、發(fā)病癥狀及治療反應，實行UPDRS評分及Hoehn-Yahr分級。溫嶺市中醫(yī)院同期健康體檢202例為對照組，男105例，女97例，年齡19～81（58.2±11.8）歲；202例中包括PD患者的健康配偶27例。所有受試者彼此間無血緣關系，且一級親屬中無PD患者。兩組研究對象在性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會同意，并獲得入選者及監(jiān)護人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 采用DNA提取純化試劑盒（德國Qiagen公司），PCR擴增試劑盒（美國Promega公司），Big-dye v3.1測序試劑盒（美國ABI公司），DYY-Ⅳ型電泳儀槽（北京六一儀器廠），L-21M高速冷凍離心機（上海賽特湘儀器公司）進行標本處理。取外周靜脈血樣本2ml（含ACD抗凝劑0.4m1）加入3ml紅細胞裂解液混勻，室溫5min，1 000r/min離心2min，移去上清液，留約100μl殘留液，搖勻使白細胞重新懸浮，5 000r/min離心2min，吸去上清液，收集白細胞懸浮液50μl。

1.2.2 基因組DNA提取及純化 按照DNA提取純化試劑盒操作步驟，結(jié)果采用凝膠電泳檢測，紫外儀觀察DNA大小，D2 000 Marker標準對照。

1.2.3 PCR擴增 根據(jù)NCBI及 ensembl基因庫中G2385R所在Exon48的DNA序列，設計G2385R引物序列，上游PF：5′-TAGCCCTGTTGTGGAAGTG-3′；下游PR：5′-TTCAGAGGAAGAAAGGAAG-3′。反應體系：10×緩沖液2.5μl，50pmol/μl上下游引物0.5μl，20mmol/L dNTP0.5μl，DNA模板100ng，TaqDNA酶0.5μl，去離子水補至25μl。反應程序：94℃預變性2min，然后94℃30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸15min。結(jié)果取5μl PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠，觀察產(chǎn)物片段大小170bp。

1.2.4 限制性片段長度多態(tài)性分析 （1）酶切反應。取PCR產(chǎn)物16μl，10×緩沖液2μl，AccI酶5U，加雙蒸水至30μl。37℃酶切過夜24h。結(jié)果取5μl PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠，紫外儀觀察。（2）基因型分析。GG型純合子170bp（野生型、沒有酶切位點）；GA型雜合子170bp+123bp；AA型純合子123bp。

1.2.5 PCR產(chǎn)物測序 由北京奧康生物技術公司完成，PCR產(chǎn)物用Qiaquick柱（Oiagen公司）過柱純化并定量。Big-dye v3.1測序kit對PCR純化產(chǎn)物進行測序，測序引物為單向引物。5μl反應體系中含待測模板150ng、單向引物3.2pmol、Big-dye v3.1mix 0.5μl。ABI 9700型擴增儀反應，反應結(jié)束后，產(chǎn)物進行純化，加入高純Hi-Di甲酰胺10μl溶解，ABI 3730基因測序儀進行檢測。檢測序列與基因組LRRK2基因標準序列比對。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，驗證入選人群是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律分別采用χ2、t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LRRK2基因G2385R基因型的檢測 LRRK2基因G2385R擴增產(chǎn)物為170bp，經(jīng)AccI酶切后，G等位基因無酶切位點仍為170bp片段；A等位基因切為123bp和47bp兩個片段，47bp條帶泳出凝膠未能顯示；GG基因型為單個170bp；GA基因型為170bp、123bp兩個條帶，AA基因型為123bp單個條帶。

2.2 LRRK2基因G2385R位點序列測定 測序結(jié)果見圖1。

圖1 LRRK2基因G2385R（C.7153G＞A）SNP位點測序圖（上圖為正常序列，下圖為雜合序列）

2.3 PD組和對照組G2385R基因型和等位基因檢測結(jié)果 將PD組分為男性PD組和女性PD組、EOPD組和LOPD組，將對照組分為男性對照組和女性對照組、EOPD對照組和LOPD對照組，分別比較LRRK2基因G2385R基因型頻率和等位基因頻率，見表1。

由表1可見，PD組中，LRRK2基因G2385R雜合攜帶者19例，GA基因型頻率9.64%，A等位基因頻率4.82%；對照組中LRRK2基因G2385R雜合攜帶者5例，GA基因型頻率2.48%，A等位基因頻率1.24%。所有研究對象均未檢測出AA基因型。統(tǒng)計學檢驗表明PD組與對照組基因型觀測值與期望值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（PD組χ2=0.84，P＞0.05；對照組χ2=0.03，P＞0.05）。PD組的基因型及等位基因頻率變異均明顯高于對照組，有顯著統(tǒng)計學意義（χ22=9.07，P＜0.01；χ2=8.79，P＜0.01）?；蛐图暗任换蝾l率在PD組與對照組、男性PD組與男性對照組、女性PD組與女生對照組、LOPD組與LOPD對照組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而EOPD組與EOPD對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 G2385R基因型頻率和等位基因頻率分布[例（%）]

2.4 G2385R多態(tài)的單因素Logistic回歸分析 見表2。

表2 G2385R多態(tài)的單因素Logistic回歸分析[例（%）]

由表2可見，攜帶GA基因型者在男性PD組中發(fā)病風險是未攜帶者4.04倍，在女性PD組中發(fā)病風險是未攜帶者6.73倍。LOPD組中，GA基因型的PD發(fā)病風險是未攜帶者4.35倍。

2.5 G2385R、性別、起病年齡及其相互作用的多因素Logistic回歸分析 見表3。

表3 G2385R、性別、起病年齡及其相互作用的多因素Logistic回歸分析

由表3可見，Logistic分析經(jīng)過性別、起病年齡校正后，G2385R變異攜帶者PD發(fā)病風險是未攜帶者5.04倍（P＜0.01）。

2.6 LRRK2基因G2385R人群歸因危險度百分比 采用G2385R變異OR值作為相對危險度估計值，對照組中G2385R變異（即GA+AA基因型）頻率作為一般人群風險基因型頻率，估算出G2385R變異人群歸因危險度百分比（PAR%）為7.82%。

2.7 基因型同臨床表型關系 見表4。

表4 G2385R變異攜帶者和非攜帶者的臨床特征比較

由表4可見，G2385R變異攜帶者和非攜帶者臨床特征比較，在性別、起病年齡、起病時癥狀、UPDRS評分和Hoehn and Yahr評級等方面，攜帶者與非攜帶者差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

G2385R被報道是第一個中國人特異的PD可能風險因子[4-5]。易感基因多態(tài)性與疾病相關性有統(tǒng)計學意義時，有3種可能：（1）等位基因通過改變氨基酸序列或穩(wěn)定性等影響基因功能，進而影響發(fā)病危險性；（2）等位基因與實際引起疾病基因位點連鎖不平衡；（3）假陽性（Ⅰ型錯誤）[5-6]。本研究結(jié)果G2385R變異與中國沿海地區(qū)漢族人群散發(fā)性PD發(fā)病密切相關，可增加PD發(fā)病風險，與以前研究相同[4-6]。多因素Logistic回歸分析顯示，變異攜帶者發(fā)病風險相對于非攜帶者是5.04倍，與中國大陸其他地區(qū)研究結(jié)果相比存在以下差別：首先，An[4]報道四川大學華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就醫(yī)PD患者中G2385R變異頻率11.8%，對照組3.3%；Li[5]報道G2385R上海瑞金醫(yī)院門診就診PD患者中的頻率5.96%，對照組為0，兩者在PD組及對照組中分布頻率差異均較大。本研究顯示G2385R變異頻率在PD中9.64%，對照組中2.48%。其次，An[4]報道G2385R變異在年輕人群及年老人群均同PD相關，其中ELPD組發(fā)病風險比LOPD組高。Li等[5]報道兩者發(fā)病風險無差別。本研究數(shù)據(jù)G2385R變異在年輕人群中與PD無相關，與年老人群PD發(fā)病具有相關性，是沿海地區(qū)漢族人群LOPD可能風險因子。第三，Li等[5]報道G2385R變異分布頻率女性患者明顯高于男性患者，性別與年齡在PD發(fā)病風險中具有交互作用。本研究結(jié)果G2385R變異頻率在男性患者及女性患者差別無統(tǒng)計學意義，性別與年齡在PD發(fā)病中無交互作用。本研究和大陸以前研究存在差別原因可能為以下情況，中國大陸不同地區(qū)種族、環(huán)境、生活習俗差別較大。本研究對象來自中國大陸浙江省溫嶺市，溫嶺市為中小城市，相對上海、成都等大城市較少外來移民，同其他地區(qū)通婚也較少，研究對象同質(zhì)性較高，同時生活習俗同其他地區(qū)差異較大，因此出現(xiàn)以上差別。

本文根據(jù)發(fā)病風險OR值作為相當危險度RR，對照組風險基因頻率作為一般人群總的暴露率，計算出G2385R人群歸因危險度百分比（PAR%）為7.82%，高于國外研究結(jié)果[6]。人群歸因危險度百分比是總體人群中某種疾病歸因于某種因素暴露所引起發(fā)病占全部發(fā)病比例，消除這個危險因素后，所產(chǎn)生對預防該疾病的效果將占有多大比重。目前中國55歲以上人口中有170萬PD患者，隨著人口老年化，還將繼續(xù)增加。按照本文獲得PAR%，推算出因暴露G2385R變異而發(fā)病患者數(shù)量較多，因此，研究G2385R在PD發(fā)病機制中作用，尋找針對性治療措施具有重要意義。

臨床表型方面，攜帶G2385R的PD患者與非攜帶者在性別、發(fā)病年齡、病程、臨床癥狀、UPDRS評分及Hoehn and Yahr分級均差異無統(tǒng)計學意義。靜止性震顫，運動遲緩是攜帶者常見起病癥狀，所有攜帶者對左旋多巴都有陽性反應，是典型特發(fā)性PD癥狀，與以前報道研究相同[3-6]。來自中國大陸2份研究報道，在攜帶者起病年齡方面存在爭論。Li[5]報道攜帶者起病年齡相對較遲，有較長病程，但沒有統(tǒng)計學差異；相反的，An[4]報道攜帶者起病年齡較早，尤其在LOPD組具有明顯統(tǒng)計學差異。本文結(jié)果顯示，PD患者中攜帶者起病年齡比非攜帶者年輕，尤其LOPD組有較明顯趨勢，但均未達到統(tǒng)計學意義，有必要進一步擴大樣本量，以確定G2385R變異是否影響了PD起病時間。G2385R變異攜帶者可能出現(xiàn)抗凋亡作用減弱，在基因與基因或基因與環(huán)境因素的相互作用下誘發(fā)PD。G2385R變異致病機制目前仍未清楚，需要進一步研究。

總之，本研究結(jié)果顯示G2385R變異與中國沿海地區(qū)漢族人群PD具有相關性，與早發(fā)性PD無相關性，攜帶變異患者具有典型PD臨床表現(xiàn)。

[1] Tan E K,Zhao Y,Tan L,et al．Analysis of LRRK2 Gly2385Arg genetic variant in non-Chinese Asians[J]．Mov Disord,2007,22(12): 1816-1818．

[2] Farrer M J,Stone J T,Lin C H,et al．LRRK2 G2385R is an ancestral risk factor for Parkinson'S disease in Asians[J]．Parkinsonism Relat Disord,2007,13(2):89-92．

[3] Kim J M,Lee J Y．The LRRK2 G2385R variant is a risk factor for sporadic Parkinson's disease in the Korean population[J]．Parkinsonism Relat Disord,20l0,16（2）:85-88．

[4] An X K,Peng R,Li T,et al．LRRK2 Gly2385Arg variant is a risk factor of Parkinson's disease among Han-Chinese from mainland China[J]．Eur J Neurol,2008,15(3):301-305．

[5] Li C,Ting Z,Qin X,et al．The prevalence of LRRK2 Gly2385Arg variant in Chinese Han population with Parkinson'S disease[J]．Mov Disord,2007,22(16):2439-2443．

[6] Zabetian C P,Yamamoto M,Lopez A N,et al．LRRK2 mutations and risk variants in Japanese patients with Parkinson'S disease [J]．Mov Disord,2009,24(7):1034-1041．

Association between G2385R polymorphisms of LRRK2 gene and Parkinson`s disease

Parkinson’s disease G2385R genetype Single nucleotide

2012-08-23）

（本文編輯：楊麗）

317500 溫嶺市中醫(yī)院（李彬斐、陳亨平、張小羅）；溫嶺市第一人民醫(yī)院（鄭昌華、王希佳）

鄭昌華，E-mail：zhengchanghua0402@163.com