郜俊清，金惠根，嚴(yán)鵬勇，張文全，武前福，劉宗軍

·基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究·

殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架對豬冠狀動(dòng)脈早期快速內(nèi)皮化及抗血栓的作用*

郜俊清，金惠根，嚴(yán)鵬勇，張文全，武前福，劉宗軍

目的：明確殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架（LBL-PLA-RAP 支架）對豬冠狀動(dòng)脈（冠脈）早期快速內(nèi)皮化及抗血栓的作用。

藥物洗脫支架；層層自組裝；殼聚糖 /肝素；內(nèi)皮化；血栓；

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:218.)

藥物洗脫支架可顯著降低冠狀動(dòng)脈（冠脈）介入治療再狹窄率的發(fā)生，但是支架內(nèi)皮化不良、支架晚期血栓形成是經(jīng)皮冠脈介入術(shù)的突出問題[1-3]。有研究表明，藥物洗脫支架置入后可出現(xiàn)支架內(nèi)血栓、聚合物高敏反應(yīng)、支架貼壁不良、動(dòng)脈瘤等并發(fā)癥[4-6]，而支架內(nèi)血栓尤其是晚期支架內(nèi)血栓是藥物洗脫支架最嚴(yán)重的并發(fā)癥，已引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。研究顯示，目前臨床應(yīng)用的主要藥物洗脫支架 (如雷帕霉素和紫杉醇洗脫支架 )在置入血管后存在支架內(nèi)皮化延遲，并可能是晚期支架內(nèi)血栓形成的主要原因[7-10]。目前改善藥物洗脫支架早期內(nèi)皮化的方法仍主要為藥物洗脫支架涂層膜的改性及所載物質(zhì)的選擇[11-15]。本課題組在前期研究[16]中成功地將殼聚糖/肝素層層自組裝涂層膜應(yīng)用于裸金屬支架表面，并表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗血栓及促進(jìn)早期內(nèi)皮化作用，該涂層膜是自主研發(fā)研究結(jié)果，已形成發(fā)明專利（專利號：200710045639.1）。本次研究是將殼聚糖/肝素層層自組裝涂層膜應(yīng)用于雷帕霉素藥物洗脫支架中，望研究出一種具備抗血栓及促進(jìn)早期內(nèi)皮化安全有效的藥物洗脫支架。

1 資料與方法

殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架（LBLPLA-RAP 支架 ）的制備：將 316 L 不銹鋼冠脈金屬裸支架（18 mm×2.5 mm～3 mm）（微創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司提供，中國 ）沉浸在酒精 /水（1:1）中作用 4 h，以除去油性污垢，然后用去離子水清洗，30℃減壓烘干 24 h。將清洗后的裸金屬支架沉浸在 3- 氨丙基乙醇溶液（購自 Acros Organics 公司，比利時(shí) ）4 h，然后用去離子水清洗，50℃常壓烘干清洗后的裸金屬支架沉浸在一個(gè)含 0.1%乙醇的3 - 氨丙基溶液（APTES，購自 Acros Organics 公司，比利時(shí)）中 37℃ 4 h，然后用去離子水沖洗，并在50℃空氣干燥。經(jīng)處理的支架置入 0.01 M 鹽酸中 2 h，再用大量的水沖洗。然后，將支架浸泡在 0.1%肝素鈉鹽水溶液（高能物理研究化工有限公司）15 min，隨后用純凈水沖洗。隨后將肝素支架置入 0.2% 乙酸與 0.1% 殼聚糖（購自西格瑪公司 ）混合溶液中 15 min，再次進(jìn)行漂洗。反復(fù)進(jìn)行上述涂層沉積，產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定靜電相互吸引作用的復(fù)合膜。最后將殼聚糖肝素支架于 30℃減壓烘干 48 小時(shí)，制備成殼聚糖 /肝素涂層膜支架（LBL 支架），該支架為自主研發(fā)，已形成發(fā)明專利（專利號：200710045639.1）。將聚乳酸與雷帕霉素 1:1 混合，將殼聚糖 /肝素涂層膜支架采用滾涂法涂抹于支架外表面，以直徑每cm 支架 50 μg 雷帕霉素藥物含量均勻涂抹于支架表面，制備成非對稱型 LBL-PLA-RAP 支架（血液面為殼聚糖/肝素涂層，血管壁面為聚乳酸與雷帕霉素），最后以 30℃減壓烘干 48 h。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及術(shù)前準(zhǔn)備：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)利用委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為廣西小香豬 9只（25公斤，6月齡，于2010-12 購自上海動(dòng)物管理中心）。所有動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其中 6 只每天給予 300 mg 阿司匹林及 150 mg 氯吡格雷抗血小板聚集，另外3只不給與抗血小板藥物干預(yù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前一夜禁食，采用 0.5 mg/kg 氯胺酮及 0.5 mg/kg 地西泮誘導(dǎo)麻醉，氣管插管保持氣道通暢，采用戊巴比妥鈉靜脈麻醉。

動(dòng)靜脈分流模型：本實(shí)驗(yàn)豬均經(jīng)阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。無菌條件下，分離豬股動(dòng)脈及股靜脈，采用消毒后的 30 cm×3 mm皮管鏈接動(dòng)靜脈，形成動(dòng)脈靜脈循環(huán)，將 LBLPLA-RAP 支架、LBL 支架與裸金屬支架于皮管內(nèi)擴(kuò)張，每種支架重復(fù)3個(gè)樣本，使用3只小香豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只小香豬中放入不同組的3個(gè)支架，每支血管置入1枚支架，將血液灌流，血流控制在 90 ml/ min，灌流 60 min，隔開管道，取出支架，所有樣品經(jīng)干燥進(jìn)行稱重、光鏡比較。

高血栓負(fù)荷模型：本實(shí)驗(yàn)豬未經(jīng)阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。將 LBL-PLA-RAP 支架、LBL 支架與裸金屬支架經(jīng) 12 個(gè)大氣壓進(jìn)行擴(kuò)張置入豬冠脈，每種支架重復(fù)3個(gè)樣本，使用3只小香豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只小香豬中放入不同組的3個(gè)支架，每支血管置入1枚支架，根據(jù)心電圖 ST 段變化及每相隔 10 min 進(jìn)行冠脈造影，并通過血管內(nèi)超聲明確血栓形成，觀察比較不同支架形成血栓的時(shí)間。

球囊損傷模型：本實(shí)驗(yàn)豬均經(jīng)阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。從股動(dòng)脈途徑進(jìn)行冠脈造影，通過定量冠脈造影選取冠脈直徑在 2.5～3.5 mm 的血管，隨機(jī)選取支架，通過 0.014 導(dǎo)絲將支架置入冠脈，以球囊擴(kuò)張，平均 12個(gè)大氣壓，擴(kuò)張 8 秒，擴(kuò)張比例以擴(kuò)張直徑：血管直徑 1.1:1的比例進(jìn)行過度擴(kuò)張，緩慢撤出球囊，重復(fù)冠脈造影，然后緩慢撤出導(dǎo)管，股動(dòng)脈修復(fù)，縫合皮膚。使用3只小香豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只小香豬中放入不同組的 3 個(gè)支架（LBL-PLA-RAP 支架、LBL 支架、裸金屬支架），每支血管置入 1 枚支架，所有豬術(shù)后每日服用阿司匹林 300 mg 及氯吡格雷 150 mg 抗血小板治療，1 周后復(fù)查冠脈造影。

組織制備：冠脈支架于第7天取出，每個(gè)支架被平均切成 3 段。1 段經(jīng) 10% 緩沖福爾馬林固定后，硬樹脂包埋，再經(jīng)硬組織切片機(jī)切片（德國萊卡切片機(jī)），經(jīng)蘇木素伊紅染色，測定血管面積及組織學(xué)分析。1段經(jīng) 1% 戊二醛固定，樣本經(jīng)冷凍干燥，采用掃描電子顯微鏡觀察（掃描電鏡，TS 5136 MM, Tescan Ltd.）。另 1 段經(jīng)免疫組化固定液固定（購自碧云天公司），通過 CD31 免疫熒光抗體（購自 Abcam 公司）進(jìn)行免疫組化，通過激光共聚焦（購自 LEICA 公司）觀察冠脈支架。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若P＜0.05 則認(rèn)為數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)靜脈分流實(shí)驗(yàn)

所有的裸金屬支架在不足1小時(shí)出現(xiàn)支架內(nèi)血流堵塞，而所有的 LBL-PLA-RAP 支架管腔內(nèi)仍保持通暢。取出支架，用磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗支架，50℃常壓烘干，見裸金屬支架表面滿覆血栓，而LBL-PLA-RAP 支架表面基本無血栓。稱重，LBLPLA-RAP 支 架血 栓重量為（0.40±0.11）mg，LBL支架血栓重量為（0.46±0.06）mg，比裸金屬支架血栓重量（9.46±2.75）mg 均低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1

表1 三種支架在動(dòng)靜脈分流模型、高血栓負(fù)荷模型及 CD31 熒光染色定量分析中的比較（±s）

2.2 高血栓負(fù)荷實(shí)驗(yàn)

裸金屬支架在（59.0±8.5）min 出現(xiàn)支架血栓，與 LBL-PLA-RAP 支架和 LBL 支架在 360 min 內(nèi)未出現(xiàn)支架血栓比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1

2.3 球囊損傷實(shí)驗(yàn)

在置入支架后的第7天，復(fù)查冠脈造影，各組均無支架內(nèi)再狹窄發(fā)生。處死實(shí)驗(yàn)豬，取出支架段冠脈，橫斷面切片經(jīng)蘇木素伊紅染色后，LBLPLA-RAP 支架、LBL 支架與裸金屬支架均無狹窄發(fā)生，也無明顯內(nèi)皮剝脫現(xiàn)象（圖1A、1B、1C）。

圖1 支架段冠脈橫斷面切片圖片。1A：LBL-PLA-RAP 支架 1B：LBL 支架 1C：裸金屬支架

另取一段經(jīng)戊二醛固定后，掃描電鏡觀察支架內(nèi)皮化，裸金屬支架表面已經(jīng)內(nèi)皮化（圖2 C），但 1000 倍掃描電鏡顯示內(nèi)皮細(xì)胞呈圓形生長，而LBL-PLA-PAR 支架（圖2 A）與 LBL 支架（圖2B）表面已經(jīng)完全內(nèi)皮化，1000 倍掃描電鏡顯示內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形順血流方向生長。

圖2 電鏡觀察支架 內(nèi) 皮化圖片。2A：LBL-PLA-RAP 支架 2B：LBL 支架2C：裸金屬支架

獲取冠脈支架后另取一段冠脈支架，將支架浸泡于專用免疫組化固定液（購自碧云天公司）中，剪開并平鋪支架，用 CD31 抗體對支架進(jìn)行免疫熒光染色，采用激光共聚焦檢測，Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示 LBL-PLA-RAP 支架內(nèi)皮覆蓋率為（82.7±16.4）%(圖3A)，LBL 支架內(nèi)皮覆蓋率為（80.7±14.1）%(圖3B)，比裸金屬支架內(nèi)皮覆蓋率（64.3±11.0）%(圖3C)均高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。表1

圖3 免疫熒光染色圖片。3A：LBL-PLA-RAP 支架 3B：LBL 支架 3C：裸金屬支架

3 討論

在本次研究中，我們首次采用支架雙面不對稱涂層法將殼聚糖/肝素涂層膜應(yīng)用于雷帕霉素藥物洗脫支架。滾涂法涂層與一般噴涂法比較，可將支架進(jìn)行單面涂層，達(dá)到支架血液表面與組織表面功能性的差異。本研究通過涂層膜對于內(nèi)皮的“高親和力”，達(dá)到早期促進(jìn)內(nèi)皮化，抗血栓生成的效果。支架的內(nèi)皮修復(fù)是血管修復(fù)的關(guān)鍵一步，支架表面內(nèi)皮早期遷移修復(fù)可以有效降低血栓的形成。

LBL-PLA-RAP 支架在體外動(dòng)靜脈分流模型中，LBL-PLA-RAP 支架與 LBL 支架具有相似的抗血栓作用，2 h 內(nèi)，支架表面幾乎沒有支架血栓粘附，而裸金屬支架表面滿布血栓。在高負(fù)荷體內(nèi)血栓模型（在未經(jīng)氯吡格雷及阿司匹林抗血小板聚集的實(shí)驗(yàn)豬）實(shí)驗(yàn)中，LBL-PLA-RAP 支架與 LBL 支架在置入支架后 360 min 內(nèi)未出現(xiàn)支架血栓表現(xiàn)，而裸金屬支架在 59 min 時(shí)就出現(xiàn)支架血栓。該實(shí)驗(yàn)更符合人體支架血栓形成的規(guī)律，進(jìn)一步明確 LBL-PLARAP支架具有良好的抗血栓作用。

在1周的整體動(dòng)物模型中，三種支架均未出現(xiàn)再狹窄，且沒有明顯的炎癥改變，而讓人感到高興的是，LBL-PLA-RAP 支架在 1 周時(shí)就已經(jīng)幾乎完全內(nèi)皮化，掃描電鏡結(jié)果顯示 LBL-PLA-RAP 支架表面已經(jīng)覆蓋了一層梭形順血流方向生長的內(nèi)皮細(xì)胞，而裸金屬支架雖也已覆蓋了內(nèi)皮細(xì)胞，但是細(xì)胞形態(tài)仍略劣于 LBL-PLA-RAP 支架。本研究，采用激光共聚焦檢測，支架表面內(nèi)皮細(xì)胞 CD31的表達(dá)，結(jié)果同樣證實(shí) LBL-PLA-RAP 支架表面幾乎完全內(nèi)皮化，在定量分析報(bào)告中也說明，其較裸金屬支架有更好的內(nèi)皮親和力，具備早期快速促進(jìn)內(nèi)皮的功能。

層層自組裝殼聚糖/肝素涂層膜，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域，本課題組在以往研究[16]中，首次將該涂層膜應(yīng)用于裸金屬支架，發(fā)現(xiàn)其具備強(qiáng)大的抗血栓及促內(nèi)皮化效果。本次研究課題組又將該涂層膜應(yīng)用于雷帕霉素藥物洗脫支架，在確保藥物洗脫支架良好藥物釋放的同時(shí)，保留涂層膜強(qiáng)大的抗血栓及促內(nèi)皮化的效果。該研究為臨床前研究，目前結(jié)果顯示該藥物支架有良好的臨床應(yīng)用前景。

結(jié)論： LBL-PLA-RAP 支架具有良好的藥物釋放曲線，并在動(dòng)靜脈分流模型、高血栓負(fù)荷模型及1周動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其仍具有強(qiáng)大的抗血栓及能夠在極早期促進(jìn)支架內(nèi)皮化。

致謝：這個(gè)項(xiàng)目是由上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目、上海市普陀區(qū)自主創(chuàng)新重大項(xiàng)目，上海市教委項(xiàng)目資助完成。

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Effect of Chitosan/Heparin Rapamycin Drug Eluting Stent on Accelerating the Early Phase Re-Endothelialization and Anti-Thrombus Properties in Porcine Coronary Artery

GAO Jun-qing, JIN Hui-gen, YAN Peng-yong, ZHANG Wen-quan, WU Qian-fu, LIU Zong-jun.

Department of Cardiology, Central Hospital of Shanghai Putuo District, Shanghai (200062), China Corresponding Author: LIU Zong-jun, Email: kevingjq@163.com

Objective: To clarify the effect of chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent on accelerating the in-stent early phase re-endothelialization and anti-thrombus properties in porcine coronary artery.Methods: A total of 9 small pigs were divided into 3 models, Arterio-venous shunt model, High thrombosis load model, and coronary artery balloon injury model. n=3 in each model. Each animal was implanted in 3 stents as chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent, chitosan/heparin coating stent, and bare metal stent. The anti-thrombus effect of chitosan/ heparin rapamycin drug eluting stent was examined with Arterio-venous shunt and High thrombosis load models, the early phase re-endothelialization effect of chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent was evaluated with 1 week-coronary artery balloon injury model.Results: Compared with bare metal stent, chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent presented the better antithrombus effect in Arterio-venous shunt and High load thrombosis models, it also showed better re-endothelialization effect in 1 week-coronary artery balloon injury model of animals.Conclusion: Chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent has strong in-stent anti-thrombus effect and may improve the early phase re-endothelialization in experimental porcine coronary artery.

Drug eluting stent; Layer-by-layer self-assembly; Chitosan/heparin; Endothelialization; Thrombus

2012-09-10）

（編輯：王寶茹）

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上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？菩膬?nèi)科 (05-II026)；上海市普陀區(qū)自主創(chuàng)新項(xiàng)目（B82）

200062 上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院 心內(nèi)科

郜俊清 住院醫(yī)師 碩士研究生 主要從事冠心病介入治療的基礎(chǔ)研究 Email:kevingjq@sina.com

劉宗軍 Email:kevingjq@163.com

R54

A

1000-3614（2013）03-0218-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.017

方法：共選取9只小香豬，每種模型（靜脈分流模型、高血栓負(fù)荷模型、球囊損傷模型）用3只小香豬，每只豬冠脈內(nèi)分別置入 3 種不同的支架（LBL-PLA-RAP 支架、殼聚糖 /肝素涂層膜支架、裸金屬支架）。通過動(dòng)靜脈分流模型與高血栓負(fù)荷模型驗(yàn)證 LBL-PLA-RAP 支架的抗血栓作用，通過 1 周豬冠脈球囊損傷模型，觀察 LBL-PLARAP支架早期內(nèi)皮化的作用。

結(jié)果：LBL-PLA-RAP 支架在動(dòng)靜脈分流模型與高血栓負(fù)荷模型中較裸金屬支架有較好的抗血栓作用，且在 1 周的球囊損傷模型中顯示較好的內(nèi)皮化作用。

結(jié)論：LBL-PLA-RAP 支架具有強(qiáng)大的抗血栓及能夠在極早期促進(jìn)支架內(nèi)皮化。