楊晉靜 , 陳海波 , 王憲云 , 范雪松 , 叢祥鳳 , 陳曦

溶血磷脂酸對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用及機制*

楊晉靜 , 陳海波 , 王憲云 , 范雪松 , 叢祥鳳 , 陳曦

目的：探討溶血磷脂酸 (LPA)對心肌細(xì)胞缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)損傷的保護作用及機制。

溶血磷脂酸；缺氧 /復(fù)氧；心肌細(xì)胞

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:222.)

缺血再灌注損傷常見于急性心肌梗死、冠狀動脈旁路移植術(shù)、心臟移植，是心血管疾病臨床治療中面臨的重要難題。缺血再灌注損傷導(dǎo)致的缺血周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡會導(dǎo)致心肌收縮力減低，心功能障礙，嚴(yán)重的甚至發(fā)生急性心力衰竭[1,2]。因此，探索防治缺血再灌注損傷的保護藥物成為心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點[3]。

溶血磷脂酸 (LPA)是一種內(nèi)源性的生物活性脂質(zhì)分子，通過特異的G蛋白耦聯(lián)受體調(diào)節(jié)廣泛的生物學(xué)功能[4]。本研究組以前發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血清LPA 水平顯著升高[5]，并指出 LPA 可能通過促進心肌細(xì)胞肥大及成纖維細(xì)胞增殖參與了心肌梗死后的心 室重 塑[6,7]。Liu 等[8]還 發(fā) 現(xiàn) LPA 能 顯 著 抑 制 無血清缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。國外報道LPA 對缺血或缺血再灌注誘導(dǎo)的器官或細(xì)胞損傷也具有保護作用[9,10]。因此，推測 LPA 可能對缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷具有保護作用。本文以缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞為模型，模擬心肌缺血再灌注損傷，研究 LPA 對 H9c2 心肌細(xì)胞缺氧 /復(fù)氧損傷的影響及機制。

1 材料與方法

試劑：H9c2 心肌細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì) 胞 庫。DMEM 培 養(yǎng) 液 和 胎 牛 血 清 購 自 美 國 Life Technologies公司；抗甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶 (GAPDH)抗 體 購 自 美 國 Sigma 公 司；缺 氧 催 化 劑 購 自法 國BioMerieux 公 司；Hoechst33342 購 自 中杉金 橋 公司；LPA3 受 體 特 異 激 動 劑 OMPT(1-oleoyl-2-Omethylrac-glycero-phosphothionate)和 LPA 購 自 美 國 Avanti公司；細(xì)胞活性檢測 (MTS)試劑盒和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -3/7（Caspase 3/7）活性檢測試劑盒購自美 國 Promega 公 司；抗 Caspase-3 抗 體， 抗 cleavedcaspase-3 抗體，抗 Bcl-2 抗體和抗 Bax 抗體均購自美國 Cell Signaling Technologies 公司。

細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組：本實驗開始于 2012-09 到2013-01 結(jié)束。原代 SD 乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)按照本實驗室以前建立的方法進行[7]。取出生后 1～3 天的 SD 乳鼠心臟，用 0.08% 胰酶消化分離，差速貼壁培養(yǎng) 1 h 棄除成纖維細(xì)胞，將心肌細(xì)胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 100 μM Brdu 的 DMEM 中培養(yǎng)。而H9c2 心肌細(xì)胞株在含 10% 胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基，37℃和 5% CO2條件下培養(yǎng)。2～3 天傳代 1 次。心肌細(xì)胞融合達到 70%～80% 時隨機分組： 對照組：細(xì)胞置于 95% 空氣，5%CO2，持續(xù)培養(yǎng) 24 h，不加任何處理；缺氧 /復(fù)氧 (H/R)組：換無血清 DMEM 培養(yǎng)液，將細(xì)胞迅速放入密閉缺氧罐中，缺氧 24 h 后，換含 10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液常氧條件下培養(yǎng) 3 h； LPA預(yù)處理 (H/R+LPA) 組和 LPA3 受體特異激動劑（OMPT）預(yù)處理（H/R+OMPT）組：細(xì)胞用不同濃度 LPA (1, 10, 25 μΜ) 或 OMPT(1，5，10 μM) 處理 1 h，然后進行缺氧 /復(fù)氧處理，缺氧過程中 LPA 或 OMPT持續(xù)存在，復(fù)氧過程中不加 LPA 和 OMPT。

臺盼藍染色：0.4% 的臺盼藍與細(xì)胞懸液以 1:1混勻，在 3 min 內(nèi)用血球計數(shù)板在顯微鏡下分別計數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)：

活細(xì)胞數(shù) ( % ) = [活細(xì)胞總數(shù) / ( 活細(xì)胞總數(shù) +死細(xì)胞總數(shù) ) ]× 100%

細(xì)胞活性檢測：細(xì)胞按 1× 104個 /孔接種于 96孔板中，每孔 100 μl。實驗結(jié)束后，直接加入 MTS反應(yīng)液 20 μl/孔，繼續(xù)在 5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h，然后迅速用酶標(biāo)儀在 490 nm 波長處檢測吸光度值。不加細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對照，實驗結(jié)果以細(xì)胞存活率表示。

Caspase-3/7 活性檢測：Caspase-3/7 活性測定采用 Caspase-3/7 活性分析試劑盒。細(xì)胞計數(shù)后，將細(xì)胞懸液調(diào)整到 4×104個細(xì)胞 /mL，在不透明的白色 96 孔板的待測各孔添加 50 μl細(xì)胞 Caspase-3/7緩沖液和 Caspase-3/7 底物混合液，室溫，孵育 2 h，孵育后的樣品板放入 VeritasTM 發(fā)光檢測儀檢測。

免疫印跡檢測：實驗處理完成的心肌細(xì)胞，收集 總 蛋 白， 冰 上 裂 解 30 min [1%TritonX-100, 20 mmol/L HEPES, 5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L 乙 二 胺四乙酸 , 1 mmol/L 乙二醇 - 雙 -（2- 氨基乙醚 ）四乙酸 , 1 mmol/L 二硫蘇 糖醇 , 1 mmol/L 苯 甲基磺 酰氟 , 1 mmol/L Na3VO4, 10 μg/ml leupeptin, 10μg/ml aprotinin, 10μg/ml pepstatin]。 測 蛋 白 濃 度， 取 30 μg 蛋白， 進行 4%～10%SDS-PAGE 凝膠電 泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用含 5% 的脫脂牛奶的 TBST封閉 1 h，一抗 4℃孵育過夜，次日洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 h, 然后壓片顯影。

流式細(xì)胞術(shù)檢測：細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，800 rpm，4℃，離心 6 min，PBS 洗 1～2 次，每個樣品加入 200 μl binding buffer 和 10 μl Annevin V， 避 光 反 應(yīng) 30 min，加入 300 μl binding buffer 和 10 μl PI，5 min 內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測?；罴?xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞分別標(biāo)記為 Annevin V-/PI-，Annevin V+/PI-，Annevin V+/PI+， Annevin V-/PI+。

統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

LPA 抑制缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞損傷結(jié)果：H9c2 心肌細(xì)胞臺盼藍染色和 MTS 檢測存活率結(jié)果顯示：H/R 組 H9c2 心肌活細(xì)胞數(shù)和 H9c2 心肌細(xì)胞存活 率較對照組明 顯減低 (P 均 ＜0.05)，H/R + LPA 組 H9c2 心肌活細(xì)胞數(shù)和 H9c2 心肌細(xì)胞存活率（25 μM 濃度除外 ）與 H/R 組相比均顯著提高（P均 ＜0.05），圖1A、1B)。另外 MTS 檢測原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率結(jié)果顯示：H/R 組原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率 較對 照組 下降 (P＜0.05)， H/R+LPA 10 μM 組 原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率較 H/R 組明顯提高 (P＜0.05，圖1C)。流式細(xì)胞術(shù)檢測 H9c2 心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：H/R 組早期 H9c2 心肌凋亡細(xì)胞比例較對照組顯著 增 加 (P＜0.05)，H/R+LPA 組 10 μM 早 期 H9c2 心肌凋亡細(xì)胞比例較 H/R 組顯著降低 (P＜0.05，圖2)。

圖1 溶血磷脂酸抑制缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞損傷。 1A： 臺盼藍染色計數(shù) H9c2 心肌細(xì)胞活細(xì)胞數(shù) 1B： MTS 檢測 H9c2 心肌細(xì)胞存活率1C：MTS 檢測原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率 1：對照組 2：缺氧／復(fù)氧組 3：缺氧／復(fù)氧＋ LPA1μM 4：缺氧／復(fù)氧＋ LPA10μM 5：缺氧／復(fù)氧＋ LPA25μM。與對照組相比*P＜0.05 與缺氧 /復(fù)氧組相比△P＜0.05 圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測 H9c2 心肌細(xì)胞早期凋亡比例圖。 與對照組相比*P＜0.05；與缺氧 /復(fù)氧組相比△P＜0.05。1：對照組 2：缺氧 /復(fù)氧組 3：缺氧 /復(fù)氧 +LPA10 μM

LPA 通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑抑制缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞損傷：Caspase-3/7 活性檢測結(jié)果顯示： H/R 組 Caspase-3/7 活性較對照組明顯增加 (P＜0.05)。H/R+LPA 組 兩 個 濃 度 (LPA 1,10 μM) H9c2 心肌細(xì)胞的 Caspase-3/7 活性較 H/R 組顯著降低 (P＜0.05，圖3)。免疫印跡檢測結(jié)果顯示：H／R組較對照組心肌細(xì)胞裂解的 Caspase-3 的蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05)。H/R+LPA 組 10 μM 濃度的心肌細(xì)胞裂解的 Caspase-3 的蛋白表達水平較 H/R組明顯降低 (P＜0.05，圖4)。

LPA3 受體激活調(diào)節(jié)線粒體凋亡蛋白抑制缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞損傷：由于缺乏 LPA 受體特異的抑制劑，本研究用 OMPT 研究介導(dǎo) LPA 抗缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo) H9c2 心肌細(xì)胞損傷的受體亞型。結(jié)果顯示：H/R+OMPT 組三個濃度較 H/R 組線粒體促凋亡Bax 蛋白表達都減少，線粒體抗凋亡 Bcl-2 蛋白表達都增加 (P＜0.05～0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (圖5)。

圖3 LPA 對缺氧 /復(fù)氧誘 導(dǎo) 的 H9c2 心 肌 細(xì) 胞Caspase-3/7 活性的影響。與 對 照 組 相 比*P＜0.05；與 缺 氧 /復(fù) 氧組 相 比△P＜0.05。余注見圖1 圖4 免疫印跡檢測 LPA 對缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌 細(xì) 胞 裂 解 的 Caspase-3蛋 白 的 影響。4A:免 疫印 跡 檢 測 Caspase-3 前體 和 裂 解 的 Caspase-3的 蛋 白 水 平。4B：Cl.caspase-3 相對 表達量柱 狀 圖 LPA：溶 血 磷 脂酸 Procaspase-3: Caspase-3前 體 Cl.caspase-3：裂 解的 Caspase-3。 與 對 照 組相 比*P＜0.05；與 缺 氧 / 復(fù)氧組相比△P＜0.05。 1：對照組 2：缺氧／復(fù)氧組 3：缺氧／復(fù)氧＋LPA1μM 4：缺氧／復(fù)氧＋ LPA5μM 5：缺氧／復(fù)氧＋ LPA10μM

圖5 OMPT 對缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞線粒體凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bax的影響。5A:免疫印跡檢測 Bax 蛋 白、Bcl-2 蛋 白水 平 5B：Bax 蛋 白 表 達水 平 柱 狀 圖 5C: Bcl-2蛋白表達水平柱狀圖 與對照 組 相比*P＜0.05；與 缺氧 /復(fù) 氧 組 相 比△P＜0.05△△P＜0.01。 OMPT：LPA3受體激動 劑 GAPDH：甘油醛-3- 磷酸脫氫酶。1：對照組 2：缺氧／復(fù)氧組 3：缺氧／復(fù)氧＋OMPT1μM 4：缺氧／復(fù)氧＋OMPT5μM 5：缺氧／復(fù)氧＋ OMPT10μM

3 討論

溶血磷脂酸是一種內(nèi)源性的生物活性脂質(zhì)分子，主要來源于血液中應(yīng)激的血小板[11]。LPA 通過 G 蛋白耦聯(lián)受體調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞學(xué)功能。本課題組早期的研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血清中 LPA 水平顯著升高[5]。并在動物實驗研究中指出：早期重塑過程中，LPA3 受體表達明顯上調(diào)，并且LPA 可以通過LPA3 受體介導(dǎo)的信號促進心肌細(xì)胞肥大以及成纖維細(xì)胞的增殖[6,7]，表明LPA-LPA3信號可能在心肌梗死后的心室重塑中扮演著重要角色。同時我們還發(fā)現(xiàn)LPA顯著減少無血清缺氧誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。本研究首次報道LPA信號在缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的保護作用。我們發(fā)現(xiàn)缺氧 /復(fù)氧導(dǎo)致 H9c2 和原代乳鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷，細(xì)胞存活率明顯降低。而LPA預(yù)處理后，明顯減少了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率，并減少早期凋亡細(xì)胞數(shù)。線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的中心?？沟蛲?Bcl-2 和促凋亡 Bax 是線粒體凋亡途徑中兩個關(guān)鍵的基因。前者通過調(diào)節(jié)線粒體細(xì)胞色素 C 的釋放抑制凋亡執(zhí)行者 caspase-3 激活，而后者調(diào)節(jié)細(xì)胞色素 C 釋放后則激活 caspase-3。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞具有活性的 Caspase-3 和裂解的 Caspase-3 蛋白表達，明顯被 LPA 預(yù)處理抑制，提示LPA通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑發(fā)揮其保護作用。重要的是，LPA3受體激動劑OMPT預(yù)處理明顯抑制缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞 Bax的蛋白表達，并提高了 Bcl-2 的蛋白表達，表明 LPA3 受體的激活參與了LPA在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的保護作用，同時表明 LPA 的確通過抑制線粒體凋亡途徑，抗缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的 H9c2 心肌細(xì)胞損傷。 LPA3 受體激動劑 OMPT 預(yù)處理明顯提高了 Bcl-2/Bax 比值，表明 LPA3 受體的激活可能通過抑制線粒體凋亡途徑，從而抗缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷。原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)過程復(fù)雜，耗時，耗力，同時貼壁性強，不適合進行流式細(xì)胞凋亡檢測，胚胎心肌細(xì)胞 H9c2 已成為代替原代心肌細(xì)胞進行缺氧或缺氧/復(fù)氧實驗研究的一種廣泛使用的心肌細(xì)胞株。同時我們在原代乳鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測中發(fā)現(xiàn)LPA的確提高缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率，這一結(jié)果有力的支持了LPA在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的保護作用。作為磷脂類分子的代表之一，LPA 分子小，結(jié)構(gòu)簡單，易透過細(xì)胞膜 , 這些特性賦予其將來作為小分子藥物的可能。特別需要指出的是，與LPA 類似的脂質(zhì)分子-1-磷酸鞘氨醇 (SIP)治療多發(fā)性硬化疾病，已經(jīng)進入臨床Ⅲ期試驗，這提示磷脂類分子可能是一種具有應(yīng)用前景的新型治療藥物。我們的研究僅在細(xì)胞水平探討了LPA對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用，進一步的整體動物實驗在將來的研究需要證實。

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The Protective Role With its Mechanism of Lysophosphatidic Acid on Hypoxia/Re-Oxygenation Induced Neonatal Rat’s H9c2 Cardiomyocyte Injury

YANG Jin-jing, CHEN Hai-bo, WANG Xian-yun, FAN Xue-song, CONG Xiang-feng, CHEN Xi.

State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

Corresponding Author: CHEN Xi, Email: chenxifw@126.com

Objectives: To investigate the protective role with its mechanism of lysophosphatidic acid (LPA) on hypoxia/reoxygenation (H/R) induced neonatal rat’s H9c2 cardiomyocyte injury.Methods: The H/R model of neonatal rat’s H9c2 cardiomyocyte was established and the experiment was divided into 4 groups. Control group, with normal H9c2 cell. H/R group, no FBS cultured H9c2 cell was incubated in hypoxia condition for 24 hours and then cultured in 10% FBS-DMEM with routine oxygen concentration for 3 hours. H/R+LPA group and H/R+OMPT (LPA3 receptor agonist) group, the cells were treated by either LPA at (1, 10, 25)μM or OMPT at(1, 5, 10)μM for 1 hour respectively, then the cells received H/R procedures. The cell viability was examined by trypan blue staining, cell caspase-3/7 activity was detected with the commercial kit, cell apoptosis was measured by flow cytometry, and apoptotic proteins were analyzed by western blot analysis.Results: Compared with Control group, H/R group had decreased cell viability and increased early stage cell apoptosis, P＜0.05 respectively. Compared with H/R group, H/R+LPA group showed increased cell viability, P＜0.05, and LPA 10μM was the best, in addition, LPA (1, 25)μM treated cells had decreased caspase-3/7 activity, P＜0.05. Comparedwith H/R group, H/R+OMPT group presented reduced Bax protein expression and elevated Bcl-2 protein expression, P＜0.05 or P＜0.01.Conclusion: LPA may protect H/R induced neonatal rat’s H9c2 cardiomyocyte injury by activating LPA3 receptor and suppressing the mitochondrial apoptotic pathway.

Lysophosphatidic acid; Hypoxia/Re-oxygenation; Cardiomyocytes

2013-01-14）

(編輯：常文靜 )

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973 計劃 2010CB529500) 國家自然科學(xué)基金資助項目 (81170154)

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室

楊晉靜 博士研究生 主要研究方向為磷脂分子及其信號調(diào)控 Email：imyangjj@163.com 通訊作者：陳曦 Email：chenxifw@126.com

R54

A

1000-3614（2013）03-0222-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.018

方法：建立 H9c2 心肌細(xì)胞和原代乳鼠心肌細(xì)胞缺氧 /復(fù)氧模型。實驗分組 : 對照組：不做任何處理； 缺氧 /復(fù)氧組 (H/R 組 )：無血清培養(yǎng)的細(xì)胞在缺氧罐中缺氧 24 h 后，換含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液在常氧條件下培養(yǎng) 3 h；LPA 預(yù)處理組 (H/R+LPA 組 )和 LPA3 受體特異激動劑（OMPT）預(yù)處理組 (H/R+OMPT 組 )：細(xì)胞分別用 LPA(1，10，25 μM) 和 OMPT(1，5，10 μM) 處理 1 h 后，進行缺氧 /復(fù)氧，復(fù)氧時不加 LPA 和 OMPT。臺盼藍染色和細(xì)胞活性試劑盒檢測細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞，Caspase-3/7 活性檢測試劑盒分析 Caspase-3/7 活性，免疫印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白包括裂解的 Caspase-3，Bcl-2 和 Bax 蛋白表達。

結(jié)果：與對照組相比，H/R 組的 H9c2 心肌細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞存活率均降低 (P 均 ＜0.05)；早期凋亡細(xì)胞數(shù)增加 (P＜0.05)。與 H/R 組相比，H/R+LPA 組的心肌細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞存活率增加 (P 均 ＜0.05)，其中以 10 μM 濃度的 LPA 作用最為明顯。10 μM LPA 也提高了原代乳鼠心肌細(xì)胞存活率 (P＜0.05)。H/R+LPA 組兩個濃度 (LPA 1,10 μM) H9c2 心肌細(xì)胞的 Caspase-3/7 活性較 H/R 組顯著降低 (P＜0.05)。同時，H/R+OMPT 組三個濃度較 H/R 組都減少線粒體促凋亡 Bax 蛋白表達，增加了線粒體抗凋亡 Bcl-2 蛋白表達 (P＜0.05 或 0.01)。

結(jié)論：LPA 可能通過激活 LPA3 受體，抑制線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑，保護缺氧 /復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷 ,為心肌缺血再灌注損傷的防治提供了新的理論依據(jù)。