閆秀梅，黃開宇，李云芳，胡偉國(guó)，張春花，鄭必霞，郭 惟

Citrin缺陷引起的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD)是SLC25A13基因突變導(dǎo)致位于線粒體內(nèi)膜的載體蛋白Citrin功能不足而形成的一種遺傳代謝病[1]。以黃疸、肝功能異常并伴有高瓜氨酸血癥、高乳酸血癥、高氨血癥、半乳糖血癥、酪氨酸血癥、低蛋白血癥等為主要臨床表現(xiàn)[2]。其致病基因SLC25A13由日本鹿兒島大學(xué)Kobayashi等[3]于1999年定位克隆，而臨床患者則由Ohura等[4]和Tazawa等[5]在2001年最初報(bào)道，之后鹿兒島大學(xué)又陸續(xù)檢測(cè)出了巴勒斯坦、以色列、韓國(guó)、中國(guó)(包括臺(tái)灣地區(qū))、捷克、美國(guó)、英國(guó)等國(guó)家的患者。國(guó)內(nèi)首例NICCD的確診見于2006年[6]，近5年在我國(guó)已有100余例相關(guān)報(bào)道，但目前罕見該病家系基因表型分析報(bào)道。我科收治2例經(jīng)基因檢測(cè)確診的NICCD患兒，并予家系基因分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　病例簡(jiǎn)介

表1SLC25A13基因6個(gè)片段引物設(shè)計(jì)片段包含突變引物序列、退火溫度及片段長(zhǎng)度

Table1The six segment primer of SLC25A13 gene include the sequence of mutational primer，annealing temperature and the segment length

外顯子　　　　　引物序列退火溫度(℃)片段長(zhǎng)度(bp)Exon6E：5′-TGAGGGCTTGTTAGATCAAGAT-3′F：5′-TTACCCAGACAACAAATTAACCT-3′60467Exon7E：5′-CATGATTAGTTGCAGTTGCT-3′F：5′-ATAGTTAATATGTGTCAATG-3′55447Exon8，9E：5′-TCACTCATTCCAGTGCCTTG-3′F：5′-CAATGCCGCAAAGGCAACTG-3′63556Exon10F：5′-ACCGTGCCTGGCCTCAGTGATG-3′R：5′-TTTACTCTTGCCCTACCCACA-3′62554Exon11E：5′-TTGGGCTGTAGCAATGTGCC-3′F：5′-CTAGATGCCTCCAGCCTACT-3′63557Exon13E：5′-CTCCTGAAACATCAGTGATGC-3′F：5′-CCTAGTAGACTCTGCCCTTG-3′61433Exon16，17E：5′-GAGAATGTGACCAGACTGAGAT-3′F：5′-CTTTCCCTACGACAACAGAGCA-3′60453

注：a=雜合突變[Ⅰ]851del4;b=雜合突變[Ⅱ]IVS11+IG>A

圖1雜合突變[Ⅰ]851del4和雜合突變[Ⅱ]IVS11+IG>A

Figure1Heterozygous mutation[Ⅰ]851del4 and[Ⅱ]IVS11+IG>A

例1：女，出生42 d。溫州人，生后混合喂養(yǎng)。母孕史無異常，足月剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.7 kg。父母均系溫州人，體健。兩系三代否認(rèn)家族性及遺傳性疾病。此次因“腹瀉半個(gè)月，皮膚黃染3 d”于2010-07-04入住我科。入院查體：皮膚蒼黃，鞏膜輕度黃染，心前區(qū)Ⅲ級(jí)收縮期雜音，腹平軟，肝肋下1.5 cm，劍突下1 cm，質(zhì)軟，邊銳，余無異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：轉(zhuǎn)氨酶升高，膽紅素雙向升高，血常規(guī)提示中度貧血，凝血功能基本正常，甲胎蛋白明顯升高。

例2：男，出生95 d。溫州人，生后配方奶粉喂養(yǎng)。母孕史無異常，孕1產(chǎn)1，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.0 kg。父母系溫州泰順人，體健。兩系三代否認(rèn)家族性及遺傳性疾病。因“皮膚、鞏膜黃染3個(gè)月，發(fā)現(xiàn)肝功能異常1 d”于2012-02-12收住我科。入院查體：皮膚、鞏膜中度黃染，腹軟，肝肋下5.0 cm，劍突下0.5 cm，質(zhì)軟，邊銳，余無異常。入院后查血常規(guī)提示輕度貧血，肝功能提示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶輕度升高，膽紅素雙向升高，以直接膽紅素升高為主，凝血功能正常，甲胎蛋白明顯升高。

2　基因檢測(cè)方法

2.1DNA提取剪取0.5 mm×0.5 mm大小血片樣，用DNA IQTMSystem-Small Sample Casework Kit(Promega Corporation，USA)抽提基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒protocol。

2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的12種已知突變?cè)诨蛏系姆植嘉恢肹7]，將其所在區(qū)域分成6個(gè)片段擴(kuò)增，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5分別為6個(gè)片段設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen(英駿)公司合成。引物設(shè)計(jì)見表1。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。

2.3抽提PCR產(chǎn)物用TIANGEN凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN BIOTECH CO.LTD，BEIJING)抽提PCR產(chǎn)物。

2.4DNA序列測(cè)定及分析以BigDye Terminator(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)進(jìn)行產(chǎn)物標(biāo)記，精制純化后用ABI Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與正常序列進(jìn)行BLAST比較。

3　診斷結(jié)果與治療措施

例1結(jié)果：尿代謝檢查高度提示酪氨酸血癥或Citrin缺陷癥。抽取患兒及其父母外周血提取基因組DNA，對(duì)SLC25A13基因行PCR和產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果與參考序列比對(duì)，分析表明患兒基因型：851del4/851del4純合突變，患兒父親基因型：851del4/——攜帶者，母親基因型：851del4/——攜帶者。治療：食用無乳糖和加強(qiáng)中鏈脂肪酸的配方奶粉，補(bǔ)充多種脂溶性維生素，熊去氧膽酸改善膽汁淤積。隨訪2.5個(gè)月，患兒黃疸消退，血生化基本恢復(fù)正?！，F(xiàn)患兒2周歲，生長(zhǎng)發(fā)育良好，無黃疸。

例2結(jié)果：尿代謝結(jié)果提示半乳糖血癥以及Citrin缺陷癥待除外。抽取患兒及其父母外周血提取基因組DNA，對(duì)SLC25A13基因行PCR和產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果與參考序列比對(duì)，分析表明患兒基因型：[Ⅰ]851del4/[Ⅱ]IVS11+IG>A的復(fù)合變異，患兒父親基因型：[Ⅱ]IVS11+IG>A/——攜帶者，母親基因型：[Ⅰ]851del4/——攜帶者(見圖1)。治療：食用無乳糖和加強(qiáng)中鏈脂肪酸的配方奶粉，補(bǔ)充多種脂溶性維生素，熊去氧膽酸改善膽汁淤積。隨訪1個(gè)月，肝功能正?！，F(xiàn)患兒1歲，生長(zhǎng)發(fā)育良好。

4　討論

NICCD的致病基因SLC25A13位于染色體7q21.3，包含18個(gè)外顯子，長(zhǎng)200 kb，編碼一種線粒體內(nèi)鈣結(jié)合天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白Citrin。SLC25A13基因突變所導(dǎo)致的Citrin缺陷癥在兒童期表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積癥和黃疸，稱為NICCD[8]；而在成人期表現(xiàn)為高氨血癥、突發(fā)的意識(shí)障礙、精神錯(cuò)亂等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，稱為成年發(fā)病的Ⅱ型瓜氨酸血癥(adult onset type Ⅱ citrullinemia，CTLN2)。NICCD在遺傳代謝病高危患者中陽(yáng)性率居第2位，僅次于甲基丙二酸血癥[9]。在臨床實(shí)踐中隨著NICCD患兒數(shù)的不斷增加，該病日益受到臨床醫(yī)生的重視。NICCD患兒目前尚缺乏成熟的臨床或者生化診斷標(biāo)準(zhǔn)，所以現(xiàn)階段應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)SLC25A13基因診斷的必要性。截至2012年4月，日本鹿兒島大學(xué)Kobayashi領(lǐng)導(dǎo)的課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SLC25A13基因的54種突變類型，包括13種無義，17種錯(cuò)義，5種插入，5種缺失，14種剪切突變。已發(fā)表的突變類型中有12種被作為分子流行病學(xué)常規(guī)篩查手段，結(jié)果顯示851del4和IVS11+lG>A在日本人中常見，而851del4、1638ins23和IVS6+5G>A則在中國(guó)人中多見[10]。我國(guó)NICCD診斷治療研究起步較晚，尚缺乏大樣本、多中心的分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)論。本研究2例患兒均為溫州籍人，突變類型分別為851del4、[Ⅰ]851de14/[Ⅱ]IVS11+lG>A，與以往文獻(xiàn)報(bào)道稍有不符。

本研究2例患兒均表現(xiàn)黃疸、肝大等癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查均有高膽紅素血癥、肝功能異常、甲胎蛋白明顯升高、貧血以及血氨升高等改變。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的升高提示患兒肝細(xì)胞有不同程度受損，高膽紅素血癥和堿性磷酸酶升高提示患兒存在膽汁淤積。NICCD是一種在亞洲地區(qū)較為常見的遺傳代謝病，以往研究認(rèn)為NICCD患兒可通過代償適應(yīng)使其臨床癥狀于1歲左右自行緩解。Ohura等[11]對(duì)75例NICCD患兒的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，僅2例患兒肝功能持續(xù)惡化并分別于5個(gè)月和10個(gè)月行肝移植術(shù)。本研究2例患兒均預(yù)后良好。雖然NICCD多數(shù)可自行緩解，但嚴(yán)重者可出現(xiàn)多種并發(fā)癥如營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育障礙、白內(nèi)障、凝血功能障礙甚至肝衰竭，部分可轉(zhuǎn)化為CTLN2[12]，預(yù)后不良，故早期診斷NICCD是非常重要的。第一，可以對(duì)新生兒進(jìn)行篩查早期診斷，Ohura等[11]通過臨床回顧性分析發(fā)現(xiàn)，日本診斷的NICCD患者約40%是在新生兒篩查中發(fā)現(xiàn)異常指標(biāo)；第二，對(duì)有家族史的高危胎兒進(jìn)行胎內(nèi)診斷[13]；第三，對(duì)患膽汁淤積性肝病的患兒早做出NICCD的診斷。鑒于NICCD臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查無特異性，且為一過性，患者往往在4～6個(gè)月齡后逐漸恢復(fù)正常，有學(xué)者強(qiáng)烈建議相關(guān)的檢查應(yīng)盡可能在4個(gè)月齡前進(jìn)行[14]，包括臨床生化、尿氣相色譜氨基酸(GC-MS)分析、血串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)分析篩查，確診有賴于SLC25A13突變基因檢測(cè)，如基因檢測(cè)與Citrin蛋白檢測(cè)相結(jié)合，可以有效彌補(bǔ)基因分析的不足之處，更有利于疾病診斷。NICCD治療以飲食控制為主。NICCD患兒通過停止母乳喂養(yǎng)，改換無乳糖和強(qiáng)化中鏈脂肪酸的特殊配方奶粉，并補(bǔ)充多種脂溶性維生素，癥狀可獲改善。雖然一些NICCD患兒未經(jīng)過特殊治療臨床表現(xiàn)也漸緩解，但亦有NICCD 患兒病情嚴(yán)重而不得不接受肝臟移植，甚至夭折[15-16]。

近來國(guó)內(nèi)兒科界對(duì)于此病的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查異常開始有一定的認(rèn)識(shí)，北京、上海和廣州等中心城市的部分醫(yī)院也陸續(xù)成功診斷NICCD患兒，但是從總體上講，本病診治知識(shí)的推廣普及還需進(jìn)一步加強(qiáng)，分子遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究開展還不多，所發(fā)現(xiàn)的SLC25A13基因突變種類尤其是新突變種類還相當(dāng)有限。因此，我國(guó)醫(yī)學(xué)界同仁應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)協(xié)作，積極開展SLC25A13基因突變研究，建立相應(yīng)的分子診斷方法，更快更好地服務(wù)廣大NICCD患者。

1Treepongkaruna S，Jitraruch S，Kodcharin P，et al.Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency:prevalence and SLC25A13 mutations among Thai infants[J].BMC Gastroenterol，2012，15(12)：141-147.

2Jiang GY,Cheng ZM,Liu KS.Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency:a histopathologic study of 10 cases[J].Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2012，41(7)：452-455.

3Kobayashi K，Sinasae DS，lijima M，et al.The gene mutated in adult-onset type Ⅱ citmllinemia encodes a putative mitochondrial carrier protein[J].Nat Genet，1999，22(2)：159-163.

4Ohura T，Kobayashi K，Tazawa Y，et al.Neonatal presentation of adult onset type + citrullinemia[J].Hum Genet，2001，108(2)：87-90.

5Tazawa Y，Kobayash IK，Ohura T，et al.Infantile cholestatic jaundice associated with adult onset type + citrullinemia[J].J Pediatr，2001，138(5)：735-740.

6宋元宗，郝虎，牛飼美晴，等.疑難病研究——Citrin缺陷導(dǎo)致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2006，8(2)：125-128.

7Wen PQ，Wang GB，Chen ZL，et al.SLC25A13 gene analysis in neonates with intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency[J].Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2011，13(4)：303-308.

8Wang JS，Wang XH，Zheng YJ，et al.Biochemical characteristics of neonatal cholestasis induced by citrin deficiency[J].World J Gastroenterol，2012，18(39)：5601-5607.

9Song YZ，Li BX，Hao H，et al.Selective screening for inbore errors of metabolism and secondlary methylmalonic aciduria in prenancy at high risk district of neural tube defects：a human metabolome study by GC-Ms in China[J].Clin Biochem，2008，41(7-8)：616-620.

10Kikuchi A，Arai-Ichinoi N，Sakamoto O，et al.Simple and rapid genetic testing for citrin deficiency by screening 11 prevalent mutations in SLC25A13[J].Mol Genet Metab，2012，105(4)：553-558.

11Ohura T，Kobayashi K，Tazawa Y，et al.Clinical pictures of 75 patients with neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency (NICCD)[J].J Inherit Metab Dis，2007，30(2)：139-144.

12Song YZ,Guo L，Yang YL，et al.Failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency:a novel clinical phenotype[J].Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2009，11(5)：328-332.

13Zhao Xin-Jing，Tang Xiao-Mei，Zha Qing-Bing，et al.Prenatal diagnosis of Citrin deficiency in a Chinese family with a fatal proband[J].Tohoku J Exp Med，2011，225(4)：273-276.

14宋元宗，小林圭子.Citrin缺陷病[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23(20)：1564-1565.

15AmoriA，Okano Y，Ozaki H,et al.Neonatal intrahepatic cholestasis caused by Citrin deficiency:severe hepatic dysfunction in an infant requiring liver transplantation[J].Eur J Pediatr，2002，161(11)：609-613.

16Yazaki M，Hineno A，Matsushima A，et al.First two cases of adult-onset type Ⅱ citrullinemia successfully treated by deceased-donor liver transplantation in Japan[J].Hepatol Res，2012，42(9)：934-939.