徐 丹，黃曉東，張 姮，吳 杰

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是慢性肝病最常見的病因之一,其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確[1]。NAFLD與胰島素抵抗有關(guān)，而胰島素抵抗患者常伴有高瘦素血癥。瘦素是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌和能量代謝的重要肽類激素,具有細(xì)胞因子的特性,通過與相應(yīng)的瘦素受體結(jié)合發(fā)揮作用，瘦素對能量攝入和消耗起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[2-3]。瘦素與瘦素受體結(jié)合調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，既往研究較多的是Janus激酶和信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路[4]，而對于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)通路的報道較少。然而,瘦素、瘦素受體、PI3-K及蛋白激酶B(PKB)在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中所起的作用仍不清楚，本研究旨在通過檢測瘦素、瘦素受體及其下游信號通路在NAFLD患者中的表達(dá)，探討其在NAFLD發(fā)生及發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年5—9月武漢市中心醫(yī)院肝膽外科收治的術(shù)前B超診斷為脂肪肝，術(shù)中肝穿刺活組織檢查證實為NAFLD 的患者30例為NAFLD組，其中男15 例，女15 例；年齡38～56歲，平均(42.0±8.4)歲。NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)參見NAFLD診療指南(中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2010年1月修訂)。另選擇同時期因膽囊結(jié)石(靜止期)及膽囊息肉住院的肝功能正常者30例為對照組，其中男14 例，女16例；年齡39～55歲，平均(43.9±8.4)歲。兩組患者性別構(gòu)成和年齡分布具有均衡性。術(shù)中經(jīng)皮肝穿刺活組織等檢查均征得患者知情同意。

1.2 血清瘦素水平測定 過夜禁食14 h，于清晨空腹臥位取肘靜脈血8 ml，5 ml送檢生化檢查，3 ml離心取上清，-70 ℃冰箱保存。采用放射免疫法(RIA)，應(yīng)用競爭機(jī)制原理，標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的瘦素和加入的125I-瘦素共同與一定量的特異性抗體產(chǎn)生競爭性免疫反應(yīng)。125I-瘦素與抗體的結(jié)合量與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中瘦素的水平呈一定的函數(shù)關(guān)系。用免疫分離試劑將結(jié)合部分(B)與游離部分(F)分離后，測定結(jié)合部分的放射性強(qiáng)度，并計算相應(yīng)結(jié)合率(B/B0)。用已知標(biāo)準(zhǔn)瘦素水平與對應(yīng)結(jié)合率作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。從標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線上查出對應(yīng)結(jié)合率在待測樣品中的水平。

1.3 免疫組織化學(xué)法 將肝臟組織取出后在4%多聚甲醛固定液中4 ℃固定16～18 h，脫水、透明、包埋、切片、常規(guī)脫水，3%過氧化氫孵育10 min后用蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡，再滴加封閉用正常血清工作液室溫孵育10 min，傾去，然后分別滴加抗瘦素多克隆抗體(美國富吉瑞必歐診斷公司，1∶100)、抗瘦素受體多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，1∶100)、抗PI3-K(p85α)多克隆抗體(美國BD Biosciences Pharmingen公司，1∶100)及抗PKB多克隆抗體(美國Cell Signaling公司，1∶100)，置濕盒密閉，4 ℃過夜。加入生物素化的抗鼠免疫球蛋白及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(美國Vector Laboratories,Burlingame公司)(1∶50)，常溫下作用1 h，避光,PBS沖洗，最后以50%甘油封片在ZEISS顯微鏡下觀察并照相。應(yīng)用計算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng),測定瘦素、瘦素受體、PI3-K(p85α)及PKB陽性表達(dá)的平均光密度值,隨機(jī)測定5個高倍視野后計算平均值作為該切片的代表值。

2 結(jié)果

2.1 對照組與NAFLD組血清瘦素水平比較 對照組血清瘦素水平為(5.55±1.96)μg/L,NAFLD組為(10.90±3.39)μg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.481，P<0.004)。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 瘦素、瘦素受體、PI3-K(p85α)、PKB主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)中，為褐色顆粒狀；NAFLD組患者肝細(xì)胞核中瘦素和PI3-K(p85α)強(qiáng)表達(dá)(見圖1)。NAFLD組較對照組肝細(xì)胞瘦素、瘦素受體及PI3-K(p85α)光密度值增高，PKB光密度值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of the optical density of leptin,OB-R,PI3-K(p85α) and PKB between the two groups

組別例數(shù)瘦素瘦素受體PI3-K(p85α)PKB對照組30029±003031±033025±005048±004NAFLD組30047±009048±008045±008025±005t值-9767-11004-1182919862P值0000000000120027

注：PI3-K=磷脂酰肌醇3-激酶，PKB=蛋白激酶B

2.3 血清瘦素水平及肝細(xì)胞中瘦素、瘦素受體、PI3-K(p85α)、PKB光密度值相關(guān)性分析 NAFLD組患者血清瘦素水平與肝細(xì)胞中瘦素光密度值呈正相關(guān)(r=0.413,P<0.05,見圖2)；肝細(xì)胞中瘦素光密度值與PI3-K(p85α) 光密度值呈正相關(guān) (r=0.365,P<0.05,見圖3)；肝細(xì)胞中PI3-K(p85α) 光密度值與PKB光密度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.854,P<0.01,見圖4)；血清瘦素水平與肝細(xì)胞中PKB光密度值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.923，P<0.01,見圖5)。對照組患者血清瘦素水平與肝細(xì)胞中瘦素光密度值呈正相關(guān)(r=0.593，P<0.05，見圖6)；肝細(xì)胞中瘦素光密度值與PI3-K(p85α) 光密度值呈正相關(guān)(r=0.795,P<0.01,見圖7)；肝細(xì)胞中PI3-K(p85α) 光密度值與PKB光密度值呈正相關(guān) (r=0.840,P<0.01,見圖8)；血清瘦素水平與PKB光密度值呈正相關(guān)(r=0.686,P<0.01,見圖9)。

3 討論

NAFLD患者存在瘦素抵抗[5]。Huang等[6]報道瘦素/PI3-K激活A(yù)kt的缺陷可能是糖尿病患者存在瘦素抵抗的一種新的機(jī)制。瘦素參與了肝臟脂肪浸潤、炎癥發(fā)生以及最終纖維變性過程，導(dǎo)致肝臟損傷[7]。有學(xué)者證明瘦素通過促進(jìn)胰島素抵抗和改變肝實質(zhì)細(xì)胞中的胰島素信號,促進(jìn)肝細(xì)胞中脂肪酸含量增加，在肝脂肪變性發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[8]。

瘦素可以模擬胰島素通過PI3-K途徑發(fā)揮對葡萄糖轉(zhuǎn)運和糖原合成的作用，瘦素激活的JAK2引致胰島素受體底物(IRS)-2酪氨酸磷酸化從而進(jìn)一步激活PI3-K,提示JAK2和IRS-2將瘦素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路耦合起來[9],PI3-K上的p85亞基與IRS,主要與IRS-1上特異的酪氨酸殘基結(jié)合,接近胰島素受體并被錨定在細(xì)胞膜。瘦素活化的磷酸化PI3-K激活催化第二信使PI-3,4,5磷酸鹽(PIP3)的形成，從而進(jìn)一步激活下游的目標(biāo),即PKB[10-11]。PI3-K是由一個的調(diào)解亞基(p85，分子量85 kDa)和一個催化亞基(p110，分子量110 kDa)組成的異二聚體復(fù)合物。p85表達(dá)最豐富的亞基是p85α。過度表達(dá)的PI3-K p85亞基可以競爭性抑制p85-p110二聚體和IRS-1相結(jié)合,從而抑制了PI3-K的活性[12-16]。與之相反,抑制p85亞基的表達(dá),可以提高p85-p110二聚體與 p85單體之間的比例，從而改善瘦素活化的PI3-K介導(dǎo)的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),最終產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng),如調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖原合成、蛋白合成、抗脂肪分解和抑制細(xì)胞凋亡等。

注：A瘦素在對照組的表達(dá)，B瘦素在NAFLD組的表達(dá)；C瘦素受體在對照組的表達(dá)；D瘦素受體在NAFLD組的表達(dá)；E PI3-K(p85α)在對照組的表達(dá)；F PI3-K(p85α)在NAFLD組的表達(dá)；G PKB在對照組的表達(dá)；H PKB在NAFLD組的表達(dá)

圖1 免疫組織化學(xué)法顯示瘦素、瘦素受體、PI3-K、PKB在對照組和NAFLD組患者肝細(xì)胞中的表達(dá)

Figure1 The expression of leptin,OB-R,PI3-K and PKB in the two groups

圖2 NAFLD組患者血清瘦素水平與肝細(xì)胞中瘦素光密度值相關(guān)性分析

Figure2 Correlation between serum leptin level and the optical density of leptin in NAFLD group

圖3 NAFLD組患者肝細(xì)胞中瘦素光密度值與PI3-K(p85α) 光密度值相關(guān)性分析

Figure3 Correlation between the optical density of leptin and PI3-K(p85α) in NAFLD group

圖4 NAFLD組患者肝細(xì)胞中PI3-K(p85α) 光密度值與PKB光密度值相關(guān)性分析

Figure4 Correlation between the optical density of PI3-K(p85α) and PKB in NAFLD group

圖5 NAFLD組患者血清瘦素水平與PKB光密度值相關(guān)性分析

Figure5 Correlation between serum leptin level and the optical density of PKB in NAFLD group

圖6 對照組患者血清瘦素水平與肝細(xì)胞中瘦素光密度值相關(guān)性分析

Figure6 Correlation between serum leptin level and the optical density of leptin in control group

圖7 對照組患者肝細(xì)胞中瘦素光密度值和PI3-K(p85α) 光密度值相關(guān)性分析

Figure7 Correlation between the optical density of leptin and PI3-K(p85α) in control group

圖8 對照組患者肝細(xì)胞中PI3-K(p85α) 光密度值與PKB光密度值相關(guān)性分析

Figure8 Correlation between the optical density of PI3-K(p85α) and PKB in control group

圖9 對照組患者血清瘦素水平和肝細(xì)胞中PKB光密度值相關(guān)性分析

Figure9 Correlation between serum leptin level and the optical density of PKB in control group

瘦素抵抗與瘦素信號的缺陷在飲食誘導(dǎo)的肥胖發(fā)生中起重要作用[17-19]。本研究中對照組血清瘦素水平與肝細(xì)胞中瘦素及PKB的光密度值均呈正相關(guān)，表明正常生理狀態(tài)下，瘦素可以有效地激活PI3-K，瘦素活化的磷酸化PI3-K進(jìn)一步激活下游目標(biāo)即PKB，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。與之相反，在NAFLD組中，隨著NAFLD患者中血清瘦素水平升高，肝細(xì)胞中的瘦素表達(dá)增加，PKB表達(dá)下降。分析其原因可能是由于升高的瘦素過度激活了PI3-K(p85α)，導(dǎo)致自由p85和p85-p110復(fù)合物之間的失衡，過度表達(dá)的PI3-K(p85α)競爭性抑制p85-p110二聚體和IRS-1相結(jié)合,從而抑制了PI3-K的活性，不能有效激活PKB，導(dǎo)致PKB的表達(dá)下降，從而產(chǎn)生瘦素抵抗。

NAFLD患者中血清瘦素水平增高，肝細(xì)胞中瘦素及瘦素受體表達(dá)增多，增多的瘦素與瘦素受體結(jié)合，過度激活了PI3-K,反而導(dǎo)致PKB的減少，下調(diào)的PKB與NAFLD的進(jìn)展有關(guān)，從而說明NAFLD中存在瘦素抵抗，而瘦素/PI3-K/PKB信號通路激活的缺陷可能是NAFLD的一種新的瘦素抵抗機(jī)制。總而言之，瘦素在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，如何將瘦素用于NAFLD的臨床治療及預(yù)防，將是下一步研究的重點。

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