免疫電鏡技術(shù)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術(shù)方法,為精確定位各種抗原的存在部位及分布，研究細胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效技術(shù)手段[1]?；赥okuyasu技術(shù)及其改良技術(shù)發(fā)展起來的冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)兼顧了組織超微結(jié)構(gòu)和抗原保存,免疫標記特異度強、敏感度高等諸多優(yōu)勢而代表著免疫電鏡技術(shù)發(fā)展的方向[2-7]。本文通過冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)應用于腎活檢病理免疫沉積物、細胞表面抗原及細胞內(nèi)抗原標記,明確其性質(zhì)及其精確定位研究,并對影響冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)相關(guān)因素進行探討,為腎臟疾病發(fā)病機制探討、闡明病因提供可靠依據(jù),為腎臟疾病臨床和基礎科研提供相應的技術(shù)基礎。

材料與方法

標本選取選取南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所腎活檢標本IgA腎病5例，輕鏈沉積病2例，糖尿病腎病5例，膜性腎病1例,腎活檢標本均經(jīng)光鏡、免疫熒光和常規(guī)電鏡明確診斷。

方法所選腎活檢標本經(jīng)冷凍超薄切片后進行免疫染色,并與Epon812、LR White Resin免疫電鏡方法對比觀察超微結(jié)構(gòu)、免疫標記(表1)。

冷凍超薄切片免疫電鏡

冷凍超薄切片取材與固定：將腎組織塊切成1 mm3的小塊,放入含2%(w/v)甲醛和0.02%(v/v)戊二醛(pH 7.4)0.1 mol/L PBS固定劑中,室溫固定2h,將固定好的組織塊用PBS緩沖液清洗兩次,每次10 min,再將其投入到含有10%明膠溶液中滲透15 min；冷凍保護處理:將明膠包埋的腎組織塊投入到2.3 mol/L蔗糖的0.1 mol/L PBS緩沖液中室溫下滲透2h,使蔗糖充分滲透到組織塊中。冷凍超薄切片：使用Leica EM FC6冷凍超薄切片機參照Tokuyasu技術(shù)進行冷凍切片,半薄切片時將切片機冷凍室溫度調(diào)節(jié)至-80℃,厚度約為250 nm,經(jīng)甲苯胺藍染色后光鏡下進行腎小球定位和復溫后進行免疫熒光標記。冷凍超薄切片時將切片機冷凍室溫度設置為-120℃,厚度約為90 nm,同時調(diào)節(jié)好靜電發(fā)生器(Antistatic)的功率,避免切片發(fā)生壓縮、卷曲,切出一定長度連續(xù)平整的超薄片之后,使用蘸有甲基纖維素-蔗糖保存液MCS(含1.5%～2%甲基纖維素,1.5 mol/L蔗糖溶液)迅速地將切片黏出,轉(zhuǎn)移到覆有formvar膜的鎳網(wǎng)上。切片保存在4℃冰箱或復溫后進行免疫標記。

表1 不同免疫電鏡方法

免疫標記冷凍超薄切片復溫后,0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗切片3次,5 min/次,5%BSAc孵育15 min以阻斷非特異性背景著色,適當濃度的一抗[IgA (1∶500兔抗人 DAKO)、κ(1∶200兔抗人 DAKO)、λ(1∶200兔抗人 DAKO)、C3aR(1∶200兔抗人Santa cruz)、Podocine(1∶100 兔抗人Santa cruz)、Nephrin(1∶100 兔抗人Santa cruz；鼠抗人 日本河內(nèi)裕)]4℃冰箱孵育過夜,空白對照組使用PBS緩沖液代替,0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗切片3次,5 min/次,二抗膠體金抗體(羊抗兔,羊抗鼠IgG gold,10 nm,AURION GOLD REAGENTS)室溫孵育2h,緩沖液充分沖洗切片,1%戊二醛固定10 min,蒸餾水充分沖洗切片,2%(w/v)甲基纖維素溶液和0.4%(w/v)酸性醋酸鈾溶液按9∶1的比例新鮮配制染色5 min,切片干燥后Hitach 7500透射電鏡下觀察和拍照。

Epon812常規(guī)免疫電鏡 腎組織塊用常規(guī)3.75%戊二醛和1%鋨酸雙固定,脫水、浸透、包埋,厚約70 nm超薄切片,覆有formvar膜的鎳網(wǎng)撈片。切片室溫下10% H2O2蝕刻10 min,0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗切片3次,5 min/次,5%BSAc孵育15 min以阻斷非特異性背景著色,適當濃度的一抗(同上)4℃冰箱孵育過夜,空白對照組用PBS緩沖液代替,0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗切片3次,每次5 min,二抗膠體金抗體(同上)室溫孵育2h,蒸餾水充分沖洗切片,醋酸鈾染色5 min,檸檬酸鉛染色10 min,切片干燥后Hitach 7500透射電鏡下觀察和拍照。

LR White Resin低溫包埋免疫電鏡 腎組織塊放入2%(w/v)甲醛和0.02%(v/v)戊二醛0.1 mol/L PBS混合固定液中,室溫固定2h,梯度乙醇脫水,浸透、LR White Resin包埋,45℃聚合48h。厚約70 nm超薄切片,覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)撈片。切片不經(jīng)10% H2O2蝕刻,余下步驟與Epon812常規(guī)免疫電鏡免疫標記相同。

免疫熒光標記 腎組織塊-80℃冷凍半薄切片后轉(zhuǎn)移至玻璃蓋玻片,切片復溫后進行免疫標記：0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗切片3次,5 min/次；5%BSAc孵育15 min以阻斷非特異性背景著色；適當濃度的一抗(同上)室溫孵育1.5h,空白對照組使用PBS緩沖液代替；緩沖液清洗3次,5 min/次；加入熒光標記的二抗孵育1h,緩沖液清洗3次,5 min/次；甘油封片后移至熒光顯微鏡下觀察和拍照。

結(jié) 果

超微結(jié)構(gòu)Epon812常規(guī)電鏡技術(shù)對腎組織、細胞超微結(jié)構(gòu)保存良好,尤其是細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞基質(zhì)精細結(jié)構(gòu),電鏡下細胞器膜性結(jié)構(gòu)顯示清晰(圖1A、B)；LR White Resin樹脂包埋法腎組織精細結(jié)構(gòu)整體固定效果滿意,細胞內(nèi)微管、糖原及細胞基質(zhì)保存較好,膜性腎病電子致密物反差較常規(guī)方法高,電子致密物和電子透亮區(qū)界限顯示更清楚,但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器膜性結(jié)構(gòu)顯示不夠清晰,保存不如常規(guī)Epon812方法(圖1C、D)。腎組織冷凍超薄切片鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)變化較小,高倍鏡下顯示細胞器如線粒體脊和質(zhì)膜、足細胞裂孔膜結(jié)構(gòu)保持較完整,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒線外膜邊緣更平滑。但是細胞內(nèi)基質(zhì)、糖原保存不理想(圖1E、F)。

標記率IgA腎病腎組織半薄冷凍切片行免疫熒光染色顯示IgA呈團塊狀沉積于系膜區(qū)(圖2A)。LR White Resin低溫包埋法、冷凍超薄切片法標記結(jié)果理想,即使是常規(guī)Epon812方法系膜區(qū)電子致密物沉積區(qū)仍可見散在金顆粒分布,周圍背景著色較低(圖2B)；LR White Resin樹脂包埋法則顯示金顆粒特異性分布于電子致密物內(nèi),陽性部位金顆粒的分布密度比常規(guī)方法高,且背景干凈(圖2C),相同的一抗、二抗稀釋度條件下,冷凍超薄切片免疫標記顯示陽性部位金顆粒密度最高,IgA沉積部位定位準確,分布特異度、敏感度最高且背景干凈(圖2D)。

輕鏈沉積病(κ和λ型輕鏈沉積病)腎組織半薄冷凍切片行免疫熒光輕鏈(κ、λ)染色顯示,κ、λ輕鏈彌漫分布于系膜區(qū)、腎小球基膜及腎小管基膜上。腎組織冷凍超薄切片免疫電鏡κ、λ免疫標記,顯示及定位效果很好,金顆粒沿著腎小球基膜內(nèi)側(cè)和腎小管基膜特異性分布,標記密度高(圖3A～C),而LR White Resin樹脂包埋法特異度和敏感度都低于冷凍超薄切片法,Epon812常規(guī)免疫電鏡方標記率則更低。

圖1 腎組織基膜和線粒體超微結(jié)構(gòu)(EM)

圖2 腎組織IgA免疫電鏡染色結(jié)果

冷凍超薄切片法對肥大細胞內(nèi)抗原C3aR的標記效果滿意,C3aR在分泌溶酶體內(nèi)特異性表達,金顆粒標記密度高、背景干凈,很好地顯示了其表達特點(圖3D、E)。在對細胞膜抗原和細胞內(nèi)骨架蛋白如足細胞相關(guān)蛋白Podocine、Nephrin進行免疫電鏡標記研究中發(fā)現(xiàn),常規(guī)免疫電鏡法和LR White Resin樹脂包埋法免疫標記為陰性,LR White Resin樹脂包埋法金顆粒標記表現(xiàn)為弱陽性或陰性,很難達到準確定位、定量的目的,而超薄冷凍切片免疫電鏡染色顯示Podocine特異性表達于足細胞和裂孔隔膜且金顆粒標記密度較高(圖3F)。值得注意的是，抗體的質(zhì)量是影響免疫標記的重要因素,單克隆與多克隆抗體在抗體效價和敏感性存在明顯的差異,通過對比發(fā)現(xiàn),相同的一抗、二抗稀釋度條件下,多克隆兔抗人Podocine、Nephrin抗體金顆粒標記密度遠高于單克隆抗體,而后者金顆粒分布明顯散在、稀疏。

圖3 腎組織λ、C3aR、Podocine超薄冷凍切片免疫電鏡染色結(jié)果

討 論

近年來，免疫電鏡技術(shù)在科研應用中越來越廣泛，而在腎活檢免疫電鏡研究中,為了獲得較好的固定效果，標本處理過程中組織抗原遭到不同程度的破壞,從而影響抗原活性，導致標記效果不理想，或者為了獲得較好的抗原表達，減少對組織處理，又影響其超微結(jié)構(gòu)，以上原因制約了免疫電鏡在臨床診斷中的應用。與Epon812常規(guī)免疫電鏡技術(shù)、LR White Resin低溫包埋免疫電鏡技術(shù)相比,基于改良的Tokuyasu技術(shù)發(fā)展起來的冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)的最大特點是輕微化學固定,冷凍保護,兼顧了組織超微結(jié)構(gòu)和抗原的保存,可以提高免疫標記陽性率,非特異性背景減低,重復性好,結(jié)果可靠。我們的研究證實，冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)在保存一定超微結(jié)構(gòu)的基礎上，標記效率和定位均較常規(guī)免疫電鏡和LR White Resin低溫包埋免疫電鏡方法明顯提高，可作為腎臟疾病診斷及科研研究的一種重要手段。其次經(jīng)冷凍保護過的腎組織可在液氮或超低溫冰箱(-80℃)冷凍組織樣本庫中長期保存，為回顧性研究提供方便。

冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)優(yōu)勢與常規(guī)樹脂包埋免疫電鏡技術(shù)不同,冷凍超薄切片法所取組織塊在-80～-120℃低溫下冷凍達到足夠的硬度直接完成超薄切片,切片復溫至室溫后再進行免疫標記,在整個標本處理過程中生物分子都保存在水環(huán)境中,超微結(jié)構(gòu)接近生理狀態(tài),能夠更理想地保存一些生物大分子的活性。由于沒有樹脂包埋劑的交聯(lián)反應,超薄切片容易暴露更多的抗原,免疫標記敏感性增強,背景著色低。此外染色液甲基纖維素-醋酸鈾使切片有良好的反差,并提供表面支持而避免切片干燥變形[8],特別是應用甲基纖維素-蔗糖作為撈片和保存液,冷凍超薄切片的細胞膜性結(jié)構(gòu)得到良好的保存[9]。一般情況下冷凍超薄切片免疫電鏡的敏感度是其他方法的數(shù)倍,一些易損抗原和含量少的抗原也能較好免疫標記和定位[10]。本研究也證實，冷凍超薄切片法能很好保存抗原，標記效果好，值得推廣應用。同時也應注意冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)的一些不足，如冷凍超薄切片設備要求高，切片具有一定的技術(shù)難度，要保存的樣本需要樣品前化學固定等。通過練習掌握冷凍超薄切片技巧，優(yōu)化樣品前化學固定方法，冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)可腎活檢病理及科研中發(fā)揮更大的優(yōu)勢。

最佳實驗條件及實驗體會

樣品預處理 免疫電鏡技術(shù)的理想目標是既能將抗原準確定位,又能觀察到近似于生活狀態(tài)下的細胞超微結(jié)構(gòu)。為了避免冷凍超薄切片從冷凍環(huán)境向室溫環(huán)境轉(zhuǎn)移的過程中遭到結(jié)構(gòu)破壞,標本組織必須選擇合適的固定劑和固定系統(tǒng)進行化學固定,研究表明不同抗原的穩(wěn)定性不同,不同固定劑對抗原物質(zhì)的影響亦存在明顯差異,Stierhof等[11]和Ripper[12]等通過甲醛、戊二醛的單獨使用和聯(lián)合使用,以及其濃度和固定時間對免疫標記影響的比較研究,發(fā)現(xiàn)甲醛濃度2%～4%、戊二醛濃度0.02%～0.05%,對免疫標記效率影響最小,又能達到較好固定組織的效果。本研究采用2%甲醛+0.02%戊二醛固定系統(tǒng)取得了較好的效果。組織塊大小則以1 mm×1 mm×1 mm為宜,取材組織過大不利于2.3 mol/L蔗糖充分滲透,未滲透部分在冷凍切片時易產(chǎn)生冰晶造成切片空洞和無法切片。

冷凍超薄切片 冷凍超薄切片耗時長、技術(shù)要求高,獲得連續(xù)、理想的冷凍超薄切片并非易事,除了前期適當?shù)臉吮竟潭?、冷凍保護處理外,操作者需要反復練習，應充分考慮到冷凍超薄切片脆弱性,貼片和切片轉(zhuǎn)移操作要輕巧,防止對樣品的擠壓損傷和減少人為假象。Liou[13]用甲基纖維素和蔗糖混合液MCS(含1.5%～2%甲基纖維素,1.5 mol/L蔗糖溶液)代替蔗糖撈片溶液(切片易碎，不易保存),本研究采用上述方法也獲得了保存良好的組織超微結(jié)構(gòu),冷凍超薄切片可長時間保存而又不影響免疫標記。

免疫標記 影響免疫標記的因素主要包括：冷凍超薄切片質(zhì)量、免疫標記的特異性和敏感性、非特異背景和切片反差。良好的冷凍超薄切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎和前提。影響切片質(zhì)量的因素包括樣品預處理固定不佳、冷凍保護蔗糖滲透不充分、液氮或-80℃冷凍時組織容易產(chǎn)生冰晶、切片空洞和碎組織擠壓，以上因素都都會導致非特異背景染色[14]。鑒于此，必須重視標本的前期處理和提高冷凍超薄切片質(zhì)量。冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)一個主要的缺點是樣品前化學固定,某些抗原標記失敗,主要是由于醛類等交聯(lián)固定劑會改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)[15],可通過對固定和不固定的實驗樣品進行免疫熒光染色,以檢測和評估化學固定劑對抗體的影響。值得注意的是,某些抗原在孵育時可能發(fā)生移位,如細胞膜脂質(zhì)成分、可溶性抗原在輕微化學固定或不充分的固定條件下更容易會造成抗原提取或移位[16-17],故化學固定劑種類、濃度及時間都應適當控制,以取得理想的標記結(jié)果。雖然冷凍超薄切片免疫電鏡方法較其他方法非特異背景著色顯著減少,但是抗體質(zhì)量、非特異性抗體吸附、孵育時間,溫度及PBS沖洗是否充分仍是非特異背景著色的主要原因。常用2%～10%BSA或5%脫脂奶粉作為阻斷劑,使用經(jīng)過乙?；幚淼?%BSA-cTM對切片封閉孵育15 min,可有效降低非特異著色。因此冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)影響和干擾因素較多,對于免疫標記沒有出現(xiàn)預期結(jié)果時,應系統(tǒng)地查找原因。實驗中必須設置陽性和陰性對照實驗，以保證染色結(jié)果的可靠性,特別是對抗原含量少、標記率低的染色,應結(jié)合光鏡、免疫組化、免疫熒光綜合判斷免疫電鏡染色結(jié)果。

小結(jié)：免疫電鏡是免疫化學技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物,作為一種在超微結(jié)構(gòu)水平上定位技術(shù)手段,冷凍超薄切片免疫電鏡是一門重要的技術(shù),為生物細胞形態(tài)學的基礎研究及臨床診斷提供有價值的直接證據(jù),隨著其技術(shù)不斷發(fā)展和完善,將在腎臟疾病臨床及科研工作中有廣泛的應用前景，發(fā)揮其更大的作用。

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