鄧雪柯 張學(xué)翠

摘 要：該研究從高錳地區(qū)地表水系的水樣和淤泥中分離得到了6株具有Mn（II）氧化能力的菌株MBR1～MBR6，利用甲醛肟法對(duì)6株菌株的除錳能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MBR6>MBR5>MBR3>MBR1>MBR2>MBR4，其中MBR3、MBR5和MBR6的除錳率均在30%以上，具有進(jìn)一步研究價(jià)值。

關(guān)鍵詞：地表水系 甲醛肟法 除錳

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-3973（2013）009-142-02

錳元素是地球地殼的主要成份之一，在自然界廣泛分布，當(dāng)水中的錳含量超過一定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，會(huì)對(duì)工業(yè)、生活及環(huán)境產(chǎn)生不利的影響，甚至表現(xiàn)出嚴(yán)重的生理毒性，對(duì)人產(chǎn)生慢性毒害。Mn（II）多存在于地下水中，但隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，廠礦污水的排放，加上全球氣候惡化，洪澇災(zāi)害頻繁發(fā)生，大量的含錳物質(zhì)被沖刷流入河流，導(dǎo)致地表水中的錳含量不斷升高。地表水錳污染已成為給水處理中一個(gè)亟待解決的問題。

目前國內(nèi)外除錳工藝的研究領(lǐng)域主要針對(duì)地下水，已取得豐富的成果，在法國、德國、保加利亞等國家的試驗(yàn)性利用已取得良好的成效。但地表水方面一直未受到特別重視，從而未進(jìn)行系統(tǒng)理論的研究。近年來世界各地及我國先后發(fā)現(xiàn)，眾多大小地表水系不同程度地受到錳的污染。由于地表水在含氧量、酸堿度、水系條件等方面與地下水有著很大區(qū)別，針對(duì)地下水的生物除錳工藝處理地表水時(shí)有著很大的局限性。因此篩選適合地表水系的具有除錳能力的菌株，研究其對(duì)Mn（II）的氧化去除能力有著巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)為除錳工藝的理論系統(tǒng)化發(fā)展進(jìn)一步奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品為重慶“錳三角”附近廠礦周邊地表水中取得水樣和淤泥，用無菌瓶保存后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定。

PYCM液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.8g，酵母浸膏0.2g，MnSO4·H2O 0.2g，K2HPO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaNO3 0.2g，CaCl2 0.1g，（NH4）2CO3 0.1g，定容至1000mL，pH值7。

PYCM固體培養(yǎng)基：1000mL PYCM液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂。

Mn（II）母液：MnSO4·H2O 0.614g，定容至200mL，終濃度1000mg/L。

TEST培養(yǎng)基：蛋白胨0.2g，酵母浸膏0.1g，NaCl 1.314g，KCl 0.056g，MgSO4·7H2O 0.924g，CaCl2 0.083g，定容至1000mL。加熱滅菌，冷卻后加入已過濾除菌的10.1mL的1M HEPES母液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的分離純化

取10mL樣品懸浮液梯度稀釋后涂布PYCM平板，置于25℃下培養(yǎng)15天，挑取棕色菌落，多次劃線分離后得到單克隆。用0.5% 鹽酸四甲基對(duì)苯二胺溶液滴加分離的菌落，初步檢測(cè)其錳（II）氧化能力。

2.2 菌株除錳能力測(cè)定

利用甲醛肟分光光度法測(cè)定。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配置濃度分別為0mg/L，2 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L和100 mg/L的Mn（II）標(biāo)準(zhǔn)液。取1mL標(biāo)準(zhǔn)液，加7mL H2O，0.1mL Na2-EDTA溶液，0.1mL甲醛肟溶液，0.36mL NaOH溶液，搖勻后靜置10分鐘，加入0.6mL 氨-鹽酸羥胺溶液后加水定容至10mL，搖勻后再靜置20分鐘，隨后利用分光光度計(jì)以純水作為對(duì)照，于450nm光下測(cè)量反應(yīng)液的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 待測(cè)菌株樣本制備

將待測(cè)菌株用1mL PYCM液體培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)48小時(shí)后，利用10mM Tris·HCl緩沖液反復(fù)離心清洗，最后懸浮稀釋至相同菌體濃度，OD610為1.0。

取4.65mL TEST培養(yǎng)基，加入250 L Mn（II）母液，再加入100 L稀釋菌液。對(duì)照組加入100 L ddH2O。25℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。

2.2.3 待測(cè)菌株除錳能力測(cè)定

將培養(yǎng)結(jié)束的菌株和對(duì)照轉(zhuǎn)移至離心管中，3000譯離心10分鐘，取上清液1mL，按照甲醛肟法測(cè)定吸光度OD450。

3 結(jié)果與分析

3.1 除錳菌株的分離篩選

通過對(duì)3處高錳地區(qū)地表水系采集的水樣和污泥樣本的梯度稀釋后涂布在PYCM固體培養(yǎng)基上，挑選棕黃色菌落，經(jīng)多次劃線純化培養(yǎng)獲得除錳菌株6株，MBR1，MBR2，MBR3，MBR4、MBR5和MBR6，滴加0.5%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺溶液的對(duì)應(yīng)菌落顏色呈深藍(lán)色。

當(dāng)具有錳氧化能力的菌株在含有Mn（II）的PYCM培養(yǎng)基中生長時(shí)，能將培養(yǎng)基中的Mn（II）氧化為Mn（IV），形成棕色沉淀，使菌落表現(xiàn)出棕黃色。因此挑選棕黃色菌落更易從生態(tài)菌群中找到具有錳氧化能力的菌落。微生物的Mn（II）氧化酶可與鹽酸四甲基對(duì)苯二胺溶液氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此利用鹽酸四甲基對(duì)苯二胺對(duì)挑選的6株除錳菌株進(jìn)行顯色反應(yīng)呈陽性，可以初步鑒定菌落具有氧化酶和對(duì)Mn（II）的氧化能力。

3.2 甲醛肟標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立

在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)分析中包括100mg/L Mn（II）標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度結(jié)果時(shí)，Mn（II）濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2<0.99，嚴(yán)重偏離線性關(guān)系，而當(dāng)去除100mg/L標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)果后可得到較好的線性關(guān)系。該現(xiàn)象可能由于100mg/L的Mn（II）濃度超出了甲醛肟法的測(cè)定范圍，反應(yīng)過程中無法將溶液中的Mn（II）全部轉(zhuǎn)化為Mn（IV），進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果偏離線性關(guān)系。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，Mn（II）的濃度與吸光度在0-80mg/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，R2=0.9997。

3.3 除錳菌株除錳能力的測(cè)定

將對(duì)照ddH2O稀釋后的菌液在50mg/L Mn（II）的TEST培養(yǎng)基中培育48小時(shí)后的上清液，利用甲醛肟法測(cè)的OD450。參照甲醛肟法的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出上清液中殘留的Mn（II）濃度，則除錳菌株對(duì)Mn（II）的去除能力為：除錳率=（原始Mn（II）濃度-殘留Mn（II）濃度）/原始Mn（II）濃度？00%。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MRB系列菌株對(duì)Mn（II）的去除率在10.0～37.2%之間，其中以MBR3、MBR5和MBR6去除Mn（II）的能力較強(qiáng)，除錳率分別為30.9%，35.6%和37.2%，此能力的產(chǎn)生可能與該菌株所處的高錳環(huán)境的脅迫選擇有關(guān)。而MBR1、MBR2和MBR4除錳率分別為23.6%，19.4%和10.0%，均低于30%，這和可能與這類細(xì)菌在高錳環(huán)境的生存機(jī)制有關(guān)，它們可能不需要通過氧化Mn（II）來調(diào)整所處微環(huán)境的Mn（II）濃度，而是更多依靠自身對(duì)錳的耐受能力或自然界菌群中其它菌對(duì)Mn（II）的協(xié)同吸附去除機(jī)制。

4 結(jié)論和討論

目前關(guān)于除錳菌株的研究多集中于地下水方面，從地下水相關(guān)環(huán)境分離具備除錳能力的菌株。但本研究針對(duì)的地表水系的環(huán)境條件與地下水系的相差很大。（1）地表水的pH值和溶解氧含量均較地下水高，適于地下水低pH值條件下的氧化Mn（II）的細(xì)菌不一定適應(yīng)地表水系環(huán)境。（2）地表水中鐵離子含量低，對(duì)除錳的干擾較地下水小。（3）地表水源的水質(zhì)較地下水復(fù)雜，影響到針對(duì)地下水的錳氧化細(xì)菌的除錳效果穩(wěn)定性。因此目前常用的處理地下水的錳氧化細(xì)菌在地表水系中無法穩(wěn)定的發(fā)揮效果，故針對(duì)地表水進(jìn)行生物除錳，需要挑選適合地表水的錳氧化細(xì)菌。

本研究從高錳地區(qū)的地表水系中分離純化后獲得6株具有除錳能力的菌株，其中有3株菌株MBR3、MBR5和MBR6的氧化Mn（II）能力較強(qiáng)，48小時(shí)的除錳效率率達(dá)到30%以上。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，地表水系中篩選到的除錳菌株氧化去除Mn（II）的效率低于部分文獻(xiàn)報(bào)道的針對(duì)地下水的除錳菌株，其原因可能存在于多方面：（1）地表水由于自然的流動(dòng)更替，雖然會(huì)出現(xiàn)Mn（II）濃度超標(biāo)，但仍低于地下水的濃度，因此生存在地表水系的微生物只需要進(jìn)化出適合地表水的氧化除錳能力。（2）地表水系水質(zhì)復(fù)雜，生物群落中微生物的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于地下水系，其個(gè)體雖然除錳能力不強(qiáng)，但群落間可通過協(xié)同增強(qiáng)作用，共同對(duì)Mn（II）進(jìn)行氧化，以降低Mn（II）濃度。（3）地表水系中的部分微生物生存依賴對(duì)高M(jìn)n（II）濃度的耐受性強(qiáng)于氧化去除能力。因此隨著對(duì)分離到的地表水系除錳菌株的除錳機(jī)制，耐錳能力進(jìn)一步進(jìn)行研究，與地下水系除錳菌株進(jìn)行比較，可揭示不同條件下微生物除錳的原理，以便進(jìn)一步開發(fā)投入環(huán)保應(yīng)用。

（基金項(xiàng)目：四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目資助（07JY029-034））

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