陳思杰　彭剛

摘要：斑馬魚是發(fā)育、遺傳以及藥物發(fā)現(xiàn)研究中常用的模式動物。作為重要的脊椎動物模式系統(tǒng)之一，斑馬魚與人類基因有高度同源性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也與哺乳動物相似。近來，斑馬魚在神經(jīng)科學(xué)研究以及生理心理學(xué)相關(guān)問題的研究中的應(yīng)用日益廣泛。研究者們對斑馬魚幼魚及成魚的行為表現(xiàn)及行為發(fā)育開展了多方面的研究。基于斑馬魚模式動物的特點及優(yōu)勢，遺傳突變和藥物篩選在對動物行為表現(xiàn)的分子機制的研究中起到重要的推動作用。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；行為學(xué)模型；行為發(fā)育；遺傳突變；藥物篩選

分類號：B845

1.前言

人類的心理活動控制行為表現(xiàn)，外在行為是內(nèi)在心理的表現(xiàn)。心理異常將導(dǎo)致認知、情緒等方面的疾病。認識各種心理現(xiàn)象的內(nèi)在細胞分子機制有助于我們更好地了解心理相關(guān)疾病，發(fā)現(xiàn)可能的治療方法。人類腦成像及遺傳相關(guān)性研究證實心理現(xiàn)象與在動物中保守的分子及基因相關(guān)，而更多對其神經(jīng)環(huán)路機制的認識來自動物模型的研究。斑馬魚是發(fā)育、遺傳以及藥物發(fā)現(xiàn)研究中常用的模式動物。斑馬魚模式動物具有良好的遺傳可操作性，便于開展對斑馬魚轉(zhuǎn)基因動物及基因敲除動物的研究。相比小鼠，斑馬魚模式動物具有個體小，易繁殖，產(chǎn)卵力高等特點（Grunwal&Eisen，2002；賈順姬，孟安明，2012）。這使得斑馬魚模式動物適用于高通量的行為分析檢測（Granato et al.，1996）以及對活性化合物的篩選（Rihel et al.，2010；Wolman，Jain，Liss，&Granato，2011）?；谶@些特點，斑馬魚模式動物可以在神經(jīng)功能環(huán)路的分子遺傳基礎(chǔ)研究以及篩選影響環(huán)路功能活性化合物的研究當(dāng)中發(fā)揮較獨特的作用。

斑馬魚成魚與幼魚都可用于行為學(xué)實驗來檢測神經(jīng)環(huán)路的功能。幼魚由于其相對簡單的行為，有限的行為參數(shù)以及高通量等特點被更普遍地應(yīng)用。而成魚具有更為多樣的行為及生理反應(yīng)，可進行更復(fù)雜實驗的行為分析。在本文中，我們將首先簡述斑馬魚中幾種常用的行為模型以及當(dāng)前對斑馬魚行為發(fā)育的研究。然后我們將介紹斑馬魚糖皮質(zhì)激素受體基因突變的研究與人抑郁癥機制之間可能的關(guān)系，并介紹高通量活性化合物篩選應(yīng)用于睡眠、非聯(lián)合型學(xué)習(xí)等行為的機制研究的結(jié)果。最后，我們將展望TALEN基因敲除技術(shù)在神經(jīng)功能環(huán)路研究中可能的應(yīng)用。

2.行為模型

2.1感覺運動反應(yīng)

斑馬魚幼魚在1周左右時就能表現(xiàn)出許多特定的刻板反應(yīng)（Wolman&Granato，2012）。通過特定的感覺刺激即可誘發(fā)這些顯著的運動反應(yīng)，即感覺運動反應(yīng)。已知神經(jīng)基礎(chǔ)的感覺運動反應(yīng)可用于基因正向篩選。George Streisinger是最早將斑馬魚作為模式生物用于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究的遺傳學(xué)家。上世紀70年代，Streisinger及其同事利用γ射線誘發(fā)視覺缺陷的突變體用于視覺引導(dǎo)行為相關(guān)基因的研究（Chakrabarti，Streisinger，Singer，&Walker，1983；Walker&Streisinger，1983）。隨后，Nusslein-Volhard，Bonhoeffer和Driever實驗室利用斑馬魚幼魚進行大規(guī)模基因篩選（Driever et al.，1996；Haffter et al.，1996），后續(xù)的工作從中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個突變，能夠影響由視覺和觸覺引起的感覺運動（Granato et al.，1996；Neuhauss et al.，1999）。其中部分突變的基因已被克隆并識別，用于研究相關(guān)的人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

簡單的感覺運動行為并非對刺激簡單不變地響應(yīng)，同時還受到更高級別神經(jīng)基質(zhì)的調(diào)控。例如脊椎動物中保守的聲驚嚇反應(yīng)還受環(huán)境和經(jīng)驗的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)強刺激前出現(xiàn)一個微弱的非驚嚇聲刺激會抑制驚嚇反應(yīng)，即前弱刺激抑制（prepulse inhibition）。利用這一現(xiàn)象，Burgess和Granato篩得前弱刺激抑制減弱突變株，表明斑馬魚在受精后5天時感覺門控已經(jīng)具有功能（Burgess&Granato，2007）。除了前弱刺激抑制，研究發(fā)現(xiàn)單一重復(fù)的聲驚嚇刺激會導(dǎo)致驚嚇反應(yīng)迅速減弱，即適應(yīng)。運用不同的行為策略研究聲驚嚇反應(yīng)有助于了解感覺信息處理，學(xué)習(xí)及認知功能障礙的潛在神經(jīng)機制。

2.2情感和記憶相關(guān)行為

2.2.1黑白偏好

研究顯示斑馬魚對于光照表現(xiàn)出顯著的選擇行為，成魚具有避開光亮環(huán)境的本能。自由狀態(tài)下，斑馬魚選擇在黑暗區(qū)域呆更長時間，這種行為可維持至少幾十分鐘。有意思的是對于光亮環(huán)境，斑馬魚幼魚（1～2周）則表現(xiàn)出偏好而非回避。作為發(fā)育進程調(diào)控的選擇逆轉(zhuǎn)，該現(xiàn)象的內(nèi)在神經(jīng)基礎(chǔ)仍待進一步研究。

Lau等證實黑白選擇行為與情緒及激勵相關(guān)（Lau，Mathur，Gould，&Guo，2011）。他們將抗焦慮藥作用于成魚，結(jié)果顯示光回避行為減少，同時視覺及運動能力不受影響。此外，基于c-los的神經(jīng)活動映射技術(shù)顯示背側(cè)前腦區(qū)（Dm）的內(nèi)側(cè)區(qū)以及腹側(cè)前腦區(qū)（Vm）的背側(cè)核在黑白選擇過程中被激活。而這兩個區(qū)域分別對應(yīng)哺乳動物的杏仁核與紋狀體。眾所周知，杏仁核和紋狀體參與情緒及激勵行為的調(diào)控。因此，黑白偏好選擇可能提供了一種探索情感及激勵行為細胞分子基礎(chǔ)的行為模型。

2.2.2新魚缸實驗

與嚙齒動物的曠場實驗類似，新魚缸實驗也利用了動物處于不熟悉環(huán)境中會尋求保護的本能。與其他物種相同，暴露于新環(huán)境中，斑馬魚會表現(xiàn)出顯著的焦慮行為，如潛游、靜止不動以及減少探索游動。直到新環(huán)境逐漸熟悉后，他們才會四處探索。利用該實驗?zāi)Ｐ?，研究者可通過收集和比較一系列行為參數(shù)來評價實驗動物的焦慮水平，例如靜止時間、進入上半部分的次數(shù)、上半部分游動時間。在研究藥物抗焦慮或致焦慮效果時，可利用該實驗?zāi)Ｐ瓦M行篩選（cachat et al.，2010）。盡管能夠提供大量行為參數(shù)，同時已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用，新魚缸實驗并不適用于所有行為學(xué)領(lǐng)域（如藥物獎勵類型）及焦慮行為（如黑白偏好）。因此，斑馬魚曠場實驗，黑自盒實驗，Y-或T-迷宮實驗等新環(huán)境實驗?zāi)Ｐ涂勺鳛樾卖~缸實驗的補充，從而綜合評價斑馬魚神經(jīng)行為表現(xiàn)的特性。

2.2.3條件性位置偏好

條件性位置偏好實驗中，一中性刺激通過與有激勵作用的非條件刺激反復(fù)匹配，從而誘導(dǎo)出趨向行為。在研究藥物濫用及成癮的嚙齒動物模型中，CPP行為廣泛存在。而第一例斑馬魚成魚CPP行為由Darland和Dowling于2001年發(fā)表（Dadand&Dowling，2001）。他們將魚缸兩側(cè)的視覺提示作為中性刺激，首先評定實驗動物的自然偏好，之后將成魚限制在不喜歡的一側(cè)，施以可卡因，成功誘導(dǎo)出偏好行為。之后，許多實驗室也采用斑馬魚CPP模型測定其他物質(zhì)的強化效應(yīng)。然而CPP的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)仍不清楚。在CPP顯示的眾多神經(jīng)物質(zhì)中，多巴胺可能是哺乳動物中研究最為透徹的。而在斑馬魚CPP模型中，多巴胺對行為表現(xiàn)也起決定性作用。多巴胺神經(jīng)元突觸前后參與該環(huán)路的其他神經(jīng)元類型，聯(lián)合型學(xué)習(xí)在該環(huán)路的發(fā)生位置仍待進一步研究。

2.2.4條件性位置回避

條件性位置回避與CPP概念相似，但行為結(jié)果相反，即一中性刺激反復(fù)與具有負面效應(yīng)的非條件刺激匹配，從而誘導(dǎo)出回避行為。斑馬魚條件性主動回避實驗裝置為一穿梭盒，中間被不透明屏障分為兩個相等區(qū)域，水下連通，斑馬魚可自由游動。成魚為避免電擊必須穿過屏障，一側(cè)的電擊與對側(cè)的光信號匹配。經(jīng)過訓(xùn)練，斑馬魚學(xué)會在測試開始10秒內(nèi)游入照亮的一側(cè)從而避免電擊。CPA模型被用于研究恐懼反應(yīng)的經(jīng)驗依賴性緩解，證明僵核在其中發(fā)揮作用（Agetsuma et al.，2010；Lee et al.，2010）。而CPA模型的神經(jīng)基礎(chǔ)仍有許多未解之謎，如參與回避反應(yīng)的神經(jīng)元件以及這些元件如何通過學(xué)習(xí)被一個最初低效價信號所激活。

2.2.5群聚行為等其他行為

群聚行為是包括斑馬魚在內(nèi)的許多小型魚類的一種社會行為，對防范捕食者及增強覓食能力起著重要的作用。研究顯示斑馬魚具有顯著且可重復(fù)的群聚行為，隨著年齡的增長群聚行為增強（Engeszer，Ryan，&Parichy，2004；Miller&Gerlai，2007）。在該實驗?zāi)Ｐ椭?，魚群的疏密程度可反映魚群的焦慮水平。在致焦慮刺激的作用下，魚群變得更緊密。反之，當(dāng)魚群處于低焦慮狀態(tài)時，個體更易從魚群中脫離，魚群也更為疏散。因此，研究者可通過魚群個體間平均距離及最近個體距離等參數(shù)來評估魚群焦慮水平。該模型可用于研究社會行為潛在的神經(jīng)環(huán)路以及藥物濫用對社會行為的影響。

新物體接近實驗也是一種新環(huán)境實驗?zāi)Ｐ?。不同于其他新環(huán)境實驗，新物體接近實驗通過在熟悉的環(huán)境中導(dǎo)人外源物體引起斑馬魚的焦慮行為（Wright，Nakamichi，Krause，&Butlin，2006）。研究者可通過分析接近新物體所花的時間，接近的頻率，靜止時間及次數(shù)等行為參數(shù)來評價實驗動物的焦慮水平。此外，新物體接近實驗還可用于研究捕食者回避及社會行為。

捕食和避免被捕食在動物生存和進化過程中起著重要作用。暴露于自然界的捕食者，如印度葉魚，能誘發(fā)斑馬魚的恐懼及類焦慮行為（Bass&Gerlai，2008）。捕食者回避實驗通常采用雙臂裝置，將捕食者置于其中一個臂中，實驗動物對捕食者回避或接近的行為趨勢就體現(xiàn)了其恐懼或焦慮水平。研究者可通過分析實驗動物與捕食者同處一臂的時間，進入捕食者所在臂的次數(shù)以及第一次進入捕食者所在臂的時間等行為參數(shù)評估外源刺激或內(nèi)源基因表達改變對其恐懼或焦慮行為的影響。

3.行為發(fā)育

3.1行為的個體發(fā)育

個體發(fā)育在經(jīng)典條件反射模型系統(tǒng)中已得到深入研究，近年更是在分子及發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)方面取得了進展。運用條件反射模型有助于揭示個體發(fā)育的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)，了解其發(fā)育及整合各部分行使行為和可塑性調(diào)控的過程。斑馬魚作為模式生物可實現(xiàn)對神經(jīng)發(fā)育及活動的實時活體成像，近年來在個體發(fā)育研究中越來越受到關(guān)注。Valente等利用經(jīng)典和操作性條件反射實驗研究斑馬魚發(fā)育過程中學(xué)習(xí)行為的出現(xiàn)（Valente，Huang，Portugues，&Engert，2012）。通過記錄受精后7天至8周斑馬魚的行為表現(xiàn)，實現(xiàn)對發(fā)育過程中學(xué)習(xí)行為的連續(xù)研究。結(jié)果顯示學(xué)習(xí)行為開始于第3周，到第6周時達到成年水平，在整個發(fā)育過程中都不斷提高。成魚經(jīng)學(xué)習(xí)短時間內(nèi)即可表現(xiàn)優(yōu)異，且學(xué)習(xí)行為明顯受視覺調(diào)控。成魚的記憶至少6小時可在行為上檢測，至少12小時之后仍可再激活。該結(jié)果與鼠中的研究結(jié)果一致：條件反射在發(fā)育過程中具有時間窗口。通過行為模型的研究找到個體發(fā)育過程中學(xué)習(xí)等行為形成關(guān)鍵時間點能夠為之后的研究提供方向。而斑馬魚眾多的轉(zhuǎn)基因株系也為個體發(fā)育中信號通路、基因調(diào)控等的研究提供了有力的研究工具。

3.2幼魚的非聯(lián)合適應(yīng)性學(xué)習(xí)

非聯(lián)合適應(yīng)性學(xué)習(xí)（fnon-associative habituation learning）作為一種簡單的學(xué)習(xí)形式，使生物能夠根據(jù)最近受到的刺激調(diào)整對感覺輸入做出的行為反應(yīng)。適應(yīng)反映了對重復(fù)非重要刺激的抑制行為反應(yīng)，同時也是神經(jīng)系統(tǒng)過濾非相關(guān)刺激的一種機制。大量不同模式生物的適應(yīng)性學(xué)習(xí)研究中所采用的參數(shù)及規(guī)則相似，提示其潛在分子機制的保守性。斑馬魚幼魚具有簡單明確固定的感覺運動行為，如O型彎、C型彎等，使其成為研究神經(jīng)環(huán)路與高通量遺傳及化學(xué)篩選的優(yōu)良脊椎模式生物。研究證實采用重復(fù)視覺刺激的間隔訓(xùn)練模塊法能引起幼魚的長期適應(yīng)（Wolman，Jain，Liss，&Granato，2011），使由刺激引起的特定感覺運動行為的改變恢復(fù)至正常水平。這一過程長達24小時且需要蛋白質(zhì)合成。而重復(fù)聲刺激能誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的短期適應(yīng)。該過程受刺激頻率以及多模態(tài)刺激引起的瞬時性非適應(yīng)的調(diào)節(jié)。由于其分子機制的保守性，可利用斑馬魚幼魚進行高通量分子篩選，檢測包括各類受體激動劑或拮抗劑等在內(nèi)的小分子物質(zhì)對于非聯(lián)合適應(yīng)性學(xué)習(xí)的作用。

4.遺傳突變及藥物篩選與神經(jīng)系統(tǒng)功能環(huán)路研究

4.1糖皮質(zhì)激素受體突變與抑郁

應(yīng)激反應(yīng)主要由下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸調(diào)節(jié)，下丘腦促。腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（eortieotropin-releasing hormone，CRH）合成和釋放增加從而促進垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素。而促·腎上腺皮質(zhì)激素則刺激腎上腺產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素。在斑馬魚和人類中，主要的糖皮質(zhì)激素均為皮質(zhì)醇。人類抑郁癥患者病癥之一即為HPA軸調(diào)節(jié)異常，皮質(zhì)醇維持高水平。但HPA軸與抑郁癥之間的聯(lián)系仍不清楚。在神經(jīng)系統(tǒng)中，皮質(zhì)醇結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體（GR）后能夠調(diào)控特定靶向基因的轉(zhuǎn)錄，包括應(yīng)激相關(guān)的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和促腎上腺皮質(zhì)激素，實現(xiàn)負反饋。GR的DNA結(jié)合序列在進化中高度保守。在HPA軸功能正常的人類中，GR的人工配體地塞米松會抑制皮質(zhì)醇的表達。而抑郁病人的HPA軸活動增強，地塞米松的抑制效果也顯著遲緩。這證明糖皮質(zhì)激素抵抗至少是抑郁癥的某種形式。Baier實驗室篩得一斑馬魚突變株，其GR的單堿基突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的缺失，應(yīng)激反應(yīng)負反饋被打斷（Griffiths et al.，2012；Ziv et al.，2012）。GR突變株HPA軸活動增強，地塞米松對皮質(zhì)醇的抑制效果遲緩，輕度壓力使其類抑郁行為增加。新魚缸實驗顯示突變株靜止增多，探索行為減少，重復(fù)實驗無適應(yīng)現(xiàn)象。人類抗抑郁藥氟西汀和苯甲二氮卓則可使行為恢復(fù)正常，這一結(jié)果與人類中的結(jié)果一致，提示脊椎動物HPA軸與情感障礙之間聯(lián)系的保守性，進一步證明糖皮質(zhì)激素抵抗，而非過多的糖皮質(zhì)激素受體信號，促進了抑郁癥的發(fā)展。而糖皮質(zhì)信號在情感行為的調(diào)控過程中具有保護功能。該突變株有助于深入研究GR在應(yīng)激反應(yīng)中的作用，也使高通量篩選新型抗抑郁藥物成為可能。

4.2藥物篩選與睡眠、非聯(lián)合型學(xué)習(xí)

傳統(tǒng)脊椎動物學(xué)習(xí)行為的研究需進行行為訓(xùn)練，測試大量動物，費時且難以應(yīng)用于大規(guī)模遺傳學(xué)及小分子篩選。因此，傳統(tǒng)大規(guī)模藥物篩選主要采用體外篩選方法，但無法反映對整體動物行為的影響，尤其對精神類藥物來說是一大局限。目前已鑒定出8000余種斑馬魚突變株，可模擬貧血、耳聾、視網(wǎng)膜變性、肌無力癥、惡性腫瘤和阿爾茲海默癥等多種人類疾病，可作為研究人類疾病的模型。利用這些模型，可簡單高效地對相關(guān)疾病進行藥物篩選，尤其對于斑馬魚發(fā)育早期行為有影響的藥物進行高通量篩選。在96孔板中放入斑馬魚幼魚，在各個孔中施以不同種類不同濃度的小分子物質(zhì)，利用視頻跟蹤系統(tǒng)記錄幼魚行為數(shù)據(jù)，對特定行為參數(shù)進行軟件分析即可得知各類小分子對于該行為的作用效果。

Rihel實驗室采用斑馬魚幼魚睡眠/覺醒行為實驗，通過測定睡眠次數(shù)、睡眠時間及覺醒活動等行為參數(shù)可實現(xiàn)小分子化合物的多維定量篩選（Rihel et al.，2010）。高通量低消耗的斑馬魚行為實驗可作為傳統(tǒng)藥物篩選方法的補充，有助于發(fā)現(xiàn)體外實驗無法察覺的藥效、副作用等。此外，行為檢測有助于解析睡眠/覺醒等復(fù)雜行為的藥理學(xué)特性，同時了解機理未知的化合物的作用機制。而Wolman等提出一種基于斑馬魚幼魚非聯(lián)合型學(xué)習(xí)行為的自動化高通量系統(tǒng)（Wolman et al.，2011）。斑馬魚幼魚具有顯著的短期適應(yīng)，其神經(jīng)環(huán)路已知。利用這一優(yōu)勢，他們對已知靶點的生物活性化合物進行高通量篩選。結(jié)果表明測試化合物的功能在斑馬魚幼魚與哺乳動物間高度保守，但仍發(fā)現(xiàn)幾種化合物以前未知的學(xué)習(xí)行為調(diào)控功能。這提示了高通量化學(xué)篩選配合高分辨率行為分析是發(fā)現(xiàn)新型認知調(diào)控分子的有力方法。

4.3TALEN技術(shù)

TALEN技術(shù)（transeription activator-like（TAL）effector nucleases）是一種嶄新的分子生物學(xué)工具。研究發(fā)現(xiàn)來自植物細菌Xanthomonas印。的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系（Boch et al.，2009）。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內(nèi)源性基因的目的。TALEN技術(shù)可構(gòu)建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶，在特異的位點打斷目標基因DNA，進而在該位點進行DNA操作，如Knock—out、Knock-in或點突變。它克服了基于鋅指蛋白的ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作變得更加簡單、方便。該技術(shù)已在斑馬魚上成功應(yīng)用，且操作簡便，成本低廉，效率還很高。通過顯微注射技術(shù)，將合成的特定基因TALEN片段注入斑馬魚受精卵即可實現(xiàn)靶向基因敲除。實驗結(jié)果顯示，TALEN技術(shù)在斑馬魚中基因敲除效率普遍可達到70%以上，個別可到達幾乎100%。配合高效的TALEN合成技術(shù)，即可實現(xiàn)高通量基因敲除株的建立。目前，運用該技術(shù)已得到數(shù)百種基因敲除突變株，為進一步研究基因的功能及其對行為的影響提供了強有力的工具。此外，斑馬魚中有上百種未知功能的非編碼RNA，運用傳統(tǒng)研究手段很難找到突破口。通過TALEN技術(shù)在斑馬魚中的高效應(yīng)用，可在短時間內(nèi)獲得百余個非編碼RNA基因敲除株，對基因敲除動物進行觀察和行為檢測即可了解這些非編碼RNA在發(fā)育及行為過程中是否發(fā)揮了作用，為非編碼RNA的研究打開了突破口。隨著TALEN技術(shù)的日益完善，最終將成為每個實驗室都能掌握的強大實驗工具，毫無疑問將有助于對各類基因功能的深入研究。

5.展望

心理紊亂會引發(fā)多種心理疾病，多伴有生理系統(tǒng)尤其是神經(jīng)系統(tǒng)的功能異常。盡管存在許多不同，斑馬魚基本心理活動的外在行為表現(xiàn)與人類相似。作為一種簡單的脊椎動物模型，斑馬魚行為模型避免了復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)對行為的綜合調(diào)控，有利于發(fā)現(xiàn)行為調(diào)控的基本神經(jīng)環(huán)路，使我們能在細胞分子水平上研究抽象心理過程如何調(diào)控具體行為表現(xiàn)。隨著斑馬魚行為研究的深入，實驗方法及行為參數(shù)分析趨于穩(wěn)定，同時新的行為模型不斷出現(xiàn)應(yīng)用于各類研究，這都將有利于斑馬魚行為學(xué)實驗的推廣，為各類研究提供新的途徑。