張建軍　劉鵬　朱寧　隋南

摘要：藥物成癮會導致相關神經環(huán)路的結構和功能長期改變。大量新的研究證據表明，在DNA序列不變的情況下，藥物成癮可通過影響不同亞型DNA甲基轉移酶（DNMTs）的表達，使腦內多個相關核團發(fā)生DNA甲基化以及基因表達的改變，進而導致神經元功能的可塑性變化。因此，DNA甲基化被視作導致成癮行為長期存在的可能機制之一。結合近幾年來的重要發(fā)現(xiàn)，本文將重點討論相關腦區(qū)的DNA甲基化在成癮行為發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以及成癮藥物影響DNA甲基化水平的可能機制，并試圖提出可深入的研究展望。

關鍵詞：藥物成癮；DNA甲基化；DNA甲基轉移酶（DNMTs）

分類號：B845

藥物成癮是一種反復發(fā)作的慢性腦疾?。˙loom，1997）。大量證據提示，成癮藥物可使腦內相關神經環(huán)路的結構和功能發(fā)生長時程改變，這是成癮行為長期存在的主要原因。神經環(huán)路的長時程改變需要染色體結構和基因表達的穩(wěn)定變化，表觀遺傳學改變可能是其內在機制。表觀遺傳學主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾（包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化和蘇素化）、染色體重塑和非編碼RNA（如RNAi）等多種機制（Delcuve，Rastegar，&Davie，2009），其中DNA甲基化（DNAmethylation）是相對穩(wěn)定的一種，常發(fā)生于CpG二核苷酸部位胞嘧啶的C5位置，可以通過調控相關基因的永久沉默（Cavalli，2006；Feng et al.，2006），進而使得相關表型得到長期保持（Hyman，Malenka，&Nestler，2006）。所以與其他表觀遺傳學修飾相比，DNA甲基化可能在生命活動的長時程改變中發(fā)揮更重要的作用。之前對DNA甲基化的研究主要關注影響發(fā)育和癌癥發(fā)生的機制，而近年來發(fā)現(xiàn)，DNA的甲基化還參與學習和長時程記憶的形成（Miller&Sweatt，2007），并可能在抑郁和藥物成癮等精神疾病中發(fā)揮重要作用（Tsankova，Renthal，Kumar，&Nestler，2007）。

藥物成癮機制涉及獎賞、動機、情緒、學習記憶和執(zhí)行功能等多種神經生物學過程。獎賞效應是人和動物反復攝取成癮藥物的主要原因之一（Volkow，Wang，F(xiàn)owler，&Tomasi，2012）。在藥物獎賞過程中，快感情緒的體驗可與伴隨的相關條件刺激匹配，這種匹配被反復強化后存儲在記憶系統(tǒng)中，形成成癮相關的長期記憶。獎賞伴隨的快感情緒體驗被認為是誘導成癮形成或進而誘發(fā)復吸的最關鍵因素，而撤藥后引起的負性情緒體驗也是驅動復吸的另一個重要原因（Koob，Caine，Parsons，Markou，&Weiss，1997；Koob，Stinus，LeMoal，&Bloom，1989）。本文將概述DNA甲基化在調節(jié)藥物獎賞、成癮情緒和記憶等相關核團功能活動的研究進展，為藥物成癮機理的研究或研發(fā)新的干預方法拓展視角。

1.伏隔核的獎賞效應與DNMTs調控

大多數(shù)成癮性藥物主要是通過激活中腦邊緣系統(tǒng)（mesolimbic system，MLS）的腹側被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）內多巴胺神經元群，經其主要傳出投射引起伏隔核（nucleus aceumbens，NAc）內多巴胺的釋放增加，從而產生愉悅感，以實現(xiàn)獎賞效應。除了VTA至NAc的投射通路以外，腦內獎賞系統(tǒng)（reward system）還包括了參與該通路調節(jié)的杏仁核、海馬以及內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）等多個核團或腦區(qū)。其中，VTA和NAc是參與獎賞的關鍵核團。成癮藥物可以導致NAc發(fā)生突觸可塑性的長期改變（Alcantara et al.，2011；Kasanetz et al.，2010），染色質重塑（Chromatin remodeling）可能是其內在機制（Kumar et al.，2005）。

成癮藥物可以影響NAc中DNA的甲基化過程。催化DNA發(fā)生甲基化的DNA甲基轉移酶（DNMTs）有DNMTl、DNMT3a和DNMT3b這3種亞型（Foulks et al.，2012）。有研究表明，急性可卡因處理可導致NAc內神經元DNA甲基化（Anieg Malinovskaja，Aonurm-Helm，Zharkovsky，&Kalda，2010），DNMTl的表達下調（LaPlant et al.，2010），但DNMT3a與DNMT3b表達水平的變化尚無定論（Artier et al.，2010；LaPlant et al.，2010）；而可卡因慢性處理及自身給藥都可以降低NAc中DNMT3a的表達，但DNMT3b不受影響（LaPlantet al.，2010）。

DNA甲基化還可能介導慢性可卡因處理導致的NAe神經元樹突棘數(shù)量的顯著增加（LaPlant et al.，2010）。也有實驗證實，抑制NAc的DNMTs可影響可卡因引起的行為敏化，并且表現(xiàn)出更強的條件位置偏愛（CPP）效應（Anier et al.，2010；LaPlant et al.，2010）。

目前，阿片類藥物成癮與DNA甲基化相關性的研究還較少。不過最近Tian等人的工作表明，甲基供體甲硫氨酸的處理可抑制可卡因CPP的獲得但不能影響嗎啡CPP的獲得（Tian et al.，2012），提示阿片類藥物成癮可能和精神興奮劑類藥物成癮有不同的DNA甲基化調節(jié)機制。

2.正負情緒調控DNA甲基化

藥物成癮者在停止用藥后會產生負性情緒狀態(tài)（Koob&Nestler，1997；Miller&Sweatt，2007），包括煩躁不安、抑郁、易激怒和焦慮等。據Wager等人的研究，覓藥行為帶來的欣快感由NAc調節(jié)通路介導，而消極情緒反應則由杏仁核來調節(jié)（Wager，Davidson，Hughes，Lindquist，&Ochsner，2008）。

急性或慢性可卡因處理都可以誘導NAc中的DNMT3a的表達降低（LaPlant et al.，2010），，可卡因戒斷后，NAc中DNMT3a表達增加（LaPlant et al.，2010），提示成癮藥物導致的正負性情緒可能雙向調節(jié)DNA甲基化水平。到目前為止，闡釋上述觀點的直接證據仍然很少。然而，對應激、抑郁樣行為、恐懼和創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）等負性情緒導致的DNA甲基化的影響的研究可以提供一些間接的證據。

有大量的證據表明，應激可以通過負性情緒機制增加實驗動物對可卡因獎賞效應的敏感性（Covington et al.，2005；Prasad，Ulibarri，&Sorg，1998；Schindler Li，&Chavkin，2010；Sorg&Kalivas，1991；Tidey&Miczek，1997），并且應激可以引發(fā)負性情緒并誘導復吸（Shaham，Erb，&Stewart，2000）。LaPlant等人用社交挫敗模型發(fā)現(xiàn)，長期應激導致的抑郁樣行為也可誘導NAc內DNMT3a的過表達，表明NAc的甲基化對應激刺激導致的細胞和行為可塑性具有重要的作用（LaPlant et al.，2010），抑郁癥患者中也檢測到了DNMTI表達的降低和DNMT3b表達的升高（Higuchi et al.，2011）；DNMT的抑制劑也可以導致抗抑郁行為（Sales et al.，2011）。還有研究表明，酒精暴露可以使杏仁核一些基因的表達發(fā)生選擇性改變（D'Addario et al.，2012），提示成癮與杏仁核DNA甲基化的相關性不容忽視。Megumi等人的研究也表明，甲基化DNA的結合蛋白MeCP2能增強基底外側杏仁核（basolateral amygdala，BLA）調控的焦慮情緒（Adachi，Autry，Covington，&Monteggia，2009）。情景恐懼條件化（contextual fearconditioning）會伴隨大鼠海馬中DNMT表達的上調（Miller&Sweatt，2007），BDNF轉錄及其DNA甲基化的變化可持續(xù)24小時（Mizuno，Dempster，Mill，&Giese，2012），PTSD樣的大鼠中也發(fā)現(xiàn)海馬部位甲基化的改變（Chertkow-Deutsher，Cohen，Klein，&Ben-Shachar，2010）。在聽覺恐懼條件反射（auditory Pavlovian fear conditioning）中也發(fā)現(xiàn)外側杏仁核（1ateral amygdala，LA）中DNMT3A表達會增加（Monsey，Ota，Akingbade，Hong，&Sehafe，2011）。綜上表明，藥物成癮可能通過引起正負性情緒進而影響DNA的甲基化。

3.海馬的甲基化強化成癮記憶的獲得和保持

成癮相關的記憶的異常保持是導致復吸的重要原因之一。已有證據表明，可卡因可以通過調節(jié)海馬部位的甲基轉移酶活動進而影響其突觸可塑性（Krasnova et al.，2008；Levenson et al.，2006；Marie-Claire et al.，2003）；而成癮藥物使海馬的突觸效能降低可能導致了成癮記憶被長久保持（Han et al.，2010；Miguens et al.，2011；Yang et al.，2004）。DNA甲基化介導了LTP（長時程增強）和LTD（長時程抑制）的改變（Bailey，Kandel，&Si，2004；Levenson et al.，2006；Sweatt，2010），這是成癮異常記憶持續(xù)存在的重要機制（Hart et al.，2010）。

近年來，有一系列的證據表明，DNA甲基化在海馬依賴的記憶形成過程中具有重要作用（Feng et al.，2010；Miller&Sweatt，2007），抑制DNMTs可以顯著抑制海馬的突觸傳遞功能（Nielsen et al.，2009）和LTP（Feng et al.，2010），DNMTl和DNMT3a介導了該過程（Feng et al.，2010）；海馬的DNA甲基化還參與了記憶的獲得和長時記憶的加工過程（Miller&Sweatt，2007），CAl還參與記憶的鞏固過程（Daumas，Halley，F(xiàn)ranc6s，&Lassalle，2005）。本實驗室先前的工作也表明，海馬的DNA甲基化還調控藥物成癮記憶的獲取和保持，而成癮記憶的提取則依賴于mPFC而不是海馬中DNMTs的活動（Han et al.，2010）。

還有研究表明，在恐懼記憶的鞏固中，增加海馬的DNA甲基化起到非常關鍵的作用（Miller&Sweatt，2007）。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，海馬CAl區(qū)DNA的甲基化對于成癮記憶的鞏固和維持也是必須的（數(shù)據待發(fā)表）。這些證據提示，海馬的DNA甲基化介導了成癮記憶的形成、保持和提取過程的突觸可塑性改變。

4.成癮藥物改變DNA甲基化的潛在分子機制

已有大量研究證明DNA甲基化在成癮藥物誘導核團功能發(fā)生長時程改變的過程中發(fā)揮重要作用。DNMTl作為cAMP反應元件結合蛋白（cAMP-responsive element binding protein，CREB）的靶點，其轉錄可能受到CREB的直接調控（Impey et al.，2004），而CREB也可以通過另一個作用靶點Spl（Impey et al.，2004），來間接調節(jié)DNMT的表達（Kinney&Pradhan，2011）。轉錄因子CREB可能是重要的調控因子。可卡因、安非他明和嗎啡都可以增加NAc內cAMP（環(huán)磷酸腺苷）水平，并激活蛋白激酶A（protein kinase A，PICA），使CREB的磷酸化增加；對于興奮劑類藥物如可卡因，還可以通過MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）或是CaMK（鈣調蛋白激酶）途徑激活CREB（Nesfler，2004；Renthal&Nestler，2008）。

成癮性藥物還可能通過影響組蛋白的乙?；瘉碚{控DNA甲基化?？煽ㄒ蚧虬卜撬魍ㄟ^CaMK途徑不僅可以磷酸化CREB，還會磷酸化組蛋白去乙酰酶5（HDAC5），，慢性酒精處理后的戒斷則可以抑制HDAC的活性（Renthal&Nestler，2008），而HDAC的抑制劑可以下調DNMTl的水平（You et al.，2008），，降低DNMT3B的mRNA的穩(wěn)定性IiXiong et al.，2005），并誘導DNA的去甲基化（Hu et al.，2000；Selker，1998）。此外，由于DNMT的轉錄依賴于Rb/E2F通路（Kinney&Pradhan，2011），而E2F與HDAC存在相互作用（Singh，Johnson，&Chellappan，2010），所以HDAC也可能通過E2F來調控DNMT的表達。

DNMT的表達也會受到小的非編碼RNA——MieroRNAs（miRNAs）的調節(jié)，miR-148，miR-152和miR-29家族都可以直接調控DNMT的表達（Braeoni，Huang，&Patel，2010；Fabbri et al.，2007）。最近有觀點認為成癮性藥物通過miRNA來改變基因表達（Dunean，2012）。雖然有證據表明可卡因對miR-8、miR-124、miR-132和miR-212的影響會作用于CREB（chandrasekar&Dreyer，2009；Eipper-Mains et al.，2011；Hollander et al.，2010；Vo et al.，2005），但是慢性酒精和尼古丁處理可以改變miR-152及miR-29的表達水平這一結果則提示成癮性藥物也可能通過miRNAs來直接調節(jié)DNA的甲基化（Guo，Chen，Carreon，&Qiang，2012；Li&van der Vaart，2011）。

DNMTs的表達發(fā)生改變后，可以調控多種藥物成癮相關基因的甲基化。有研究表明可卡因處理可以導致蛋白質磷酸酶1的催化亞基（protein phosphatase-1 catalytic subunit，PPlc）啟動子區(qū)域DNA甲基化增加，相反fosB啟動子處的甲基化降低，fosB的轉錄上調（Anier et al.，2010），多巴胺轉運體基因DAT（Nieratschker et al.，2012）、神經激肽3受體（neurokinin3-receptor，NK3-R）基因TACR3也可能受到影響（Barros et al.，2011），最終影響到成癮行為。

5.研究展望

DNA甲基化是成癮機制研究近年來關注的熱點。深入研究DNA甲基化機制有助于理解藥物成癮行為長期性改變的病理基礎。

以下幾點展望值得期待：1）目前的研究仍然主要集中在NAc和海馬等核團，中腦邊緣系統(tǒng)中其他重要核團有待深入，比如與成癮行為密切相關的VTA、杏仁核等重要結構；2）不同藥物導致的甲基化機制仍需進一步了解，例如，阿片類藥物成癮的DNA甲基化機制還不清楚；3）某些成癮相關重要基因的甲基化如何影響藥物成癮行為，例如，多巴胺轉運體DAT基因、fosB基因。也需要更多的探索；4）DNA的甲基化與組蛋白的修飾并不是孤立存在的，二者之間存在復雜的相互作用關系（Ooi et al.，2007；Robertson&Wolffe，2000），同時，對組蛋白修飾的研究也將有助于全面理解DNA甲基化在藥物成癮中的作用；5）DNA的主動去甲基化在哺乳動物中似乎也是存在的（Kouzmenko，Ohtake，F(xiàn)ujiki，&Kato，2010），去甲基化機制研究應該被重視；6）成癮藥物盜用了自然獎賞通路，產生更強的獎賞效應。那么，自然獎賞物如美食、性等刺激，如何影響基因和染色體修飾還需要更多的研究。