張星煒，房寶玲

（1.邯鄲市環(huán)境保護(hù)局，河北 邯鄲 056000；2.邯鄲學(xué)院，河北 邯鄲 056000）

在世界范圍內(nèi)，病蟲害一直是制約農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要因素。隨著研究的深入，利用微生物制劑殺蟲防病也已經(jīng)成為研究最熱之點(diǎn)［1］。蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis簡稱Bt）是目前全球應(yīng)用最廣泛、最有效的微生物殺蟲劑，具有殺蟲特異性高、毒力高及無公害污染等特點(diǎn)。它的主要作用機(jī)理是靠Bt芽孢形成期的細(xì)胞能夠合成由一種或多種殺蟲蛋白質(zhì)起作用［2］，但對(duì)農(nóng)作物病原細(xì)菌并不起作用。目前一些細(xì)菌病害對(duì)植物造成毀滅性侵染，如侵染馬鈴薯的軟腐病；水稻、棉花、菜豆的白葉枯病；蕃茄、大豆、小麥、水稻的青枯病等［3］。植物病原細(xì)菌侵染寄主組織后，不是立即使農(nóng)作物致病，而是每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞分泌一種可溶性的小分子信號(hào)分子——酰基高絲氨酸內(nèi)酯（Acyl－h(huán)omoserine lactone，簡稱AHL），隨著細(xì)菌的生長，細(xì)菌群體密度提高，AHL的濃度逐漸增大，當(dāng)環(huán)境中的AHL積累到臨界濃度時(shí)，AHL誘導(dǎo)啟動(dòng)細(xì)菌一系列致病基因的表達(dá)產(chǎn)生致病力，使寄主農(nóng)作物感?。?］。因此可以設(shè)想，如果將AHL作為靶分子，人為地阻斷或消除AHL的積累，使其難以達(dá)到誘導(dǎo)致病因子表達(dá)的臨界濃度，病原菌將喪失致病力。本研究旨在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將我們已經(jīng)成功地克隆到的AHL水解酶基因?qū)胩K云金芽孢桿菌中，構(gòu)建成具有抗植物細(xì)菌病害的Bt工程菌。從而利用Bt毒蛋白的殺蟲作用和AHL水解酶水解AHL的特性，達(dá)到既能殺蟲又能使植物病原細(xì)菌失去致病力的雙重效果。這為生物防治農(nóng)作物病蟲害開辟了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

E.coliDH5α本實(shí)驗(yàn)室保存，宿主殺蟲菌Bt由生物所微生物研究室提供，采用從原始菌接入LB平板培養(yǎng)基中長出的菌作為測試菌。

1.1.2 質(zhì)粒

pUC18－ss10，抗Ap，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；pHT304，抗Ap＋Em，由武漢病毒研究所提供并保存；pKS＋質(zhì)粒本試驗(yàn)室保存；pKSJ－ss10質(zhì)粒這次實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建；pHTss10304這次實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接等操作方法見文獻(xiàn)［5］。

用EcoRI和BamHI雙酶切質(zhì)粒，回收ss10基因片段，插入到質(zhì)粒pKS＋的EcoRI和BamHI雙酶切位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pKSJ－ss10。然后用SacI和SalI雙酶切pKSJ－ss10，回收攜帶ss10基因片段，插入到Bt－E.coli的穿梭載體pHT304的SacI和SalI雙酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了pHTss10304穿梭質(zhì)粒。

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

1.2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，見文獻(xiàn)［6］。

1.2.2.2 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化Bt

將Bt單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液中，在30℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5－0.6；培養(yǎng)物在冰水中放置5－10min，4℃，5000g離心20min，棄上清，用100ml 0－4℃甘油雙蒸水溶液懸浮洗滌細(xì)胞2次；加入等體積10%甘油小溶液合裝成5ml管；加1ul質(zhì)粒，混勻，吸150ul到1ml轉(zhuǎn)化杯中，冰水放置5min；調(diào)基因?qū)雰x的參數(shù)1.25kV，5uF，800－1000Ω；按放電開關(guān)后，快速加入1ml SOC培養(yǎng)基，并用吸管將菌液轉(zhuǎn)至無菌的小管中，37℃下，100rpm振蕩培養(yǎng)60min；將上述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂于含抗性培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑單菌落、提取質(zhì)粒酶切鑒定。

1.2.3 攜帶ss10基因的穿梭載體的鑒定

（1）PCR鑒定：以質(zhì)粒為模板，以5′GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG ATG T 3′和5′ATC GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT TAT TTC G 3′為引物，反應(yīng)條件為94℃5min，（94℃30sec，59℃45sec，72℃2min）25個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃pause，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（2）酶切鑒定：利用Sac I和Sal I雙酶切質(zhì)粒，條件為37℃水預(yù)1h，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 質(zhì)粒穩(wěn)定性的檢測

重組菌株在沒有抗性的LB液體培養(yǎng)基中傳代20次后，稀釋涂布在LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至單菌落，分別挑取100個(gè)單菌落于雙抗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，來觀察有多少個(gè)單菌落帶有雙抗性，以確定該質(zhì)粒是否有穩(wěn)定性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 攜帶水解酶基因ss10穿梭載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

借助中間載體pKS＋將純化的水解酶ss10基因兩端EcoRI和BamHI兩酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為sacI和salI雙酶切位點(diǎn)最后將該片段插入到pHT304質(zhì)粒的sacI和salI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成攜帶水解酶基因ss10穿梭載體pHT304ss10。將該質(zhì)粒CaCl2法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒，酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，最后利用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的雙元載體轉(zhuǎn)化到對(duì)白菜青蟲具有良好殺死作用效果的Bt中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR基因擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得4個(gè)具有雙抗性的Bt工程菌，分別標(biāo)記24、33、34、36。圖1和圖2是以33號(hào)為例進(jìn)行的PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒酶切鑒定。

圖1 質(zhì)粒PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

圖2 質(zhì)粒酶切電泳圖

圖3 所構(gòu)建質(zhì)粒的模式圖

從上圖可知水解酶基因ss10已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化到穿梭載體上了，并且可以說明該穿梭載體已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)化到宿主Bt菌中。為此可以說明已經(jīng)成功地構(gòu)建了具有能夠抑菌和抗蟲雙重效果的工程菌，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

2.2 重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的鑒定

將在成功構(gòu)建的Bt33號(hào)工程菌在沒有抗性的LB液體培養(yǎng)基中傳代20次后，稀釋涂布在LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至單菌落，由于該工程菌具有Ap和Em雙抗性，所以挑取100個(gè)單菌落分別于Ap和Em雙抗LB液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)48h，最終99個(gè)單菌落具有雙抗性。這個(gè)結(jié)果也說明構(gòu)建的該重組質(zhì)粒具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論與討論

本研究借助一個(gè)中間質(zhì)粒pKS＋，從攜帶水解酶ss10的載體pUC18－ss10上成功地將水解酶基因ss10轉(zhuǎn)移到E.coli－Bt的穿梭載體pHT304上，成功構(gòu)建了穿梭載體pHTss10304。由于基因ss10在表達(dá)時(shí)是有方向的，它是在兩個(gè)酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I之間，方向是從BamH I到EcoR I進(jìn)行表達(dá)，而將該基因直接克隆到穿梭載體pHT304上方向正好相反，該基因不會(huì)表達(dá)，所以不能將該基因直接克隆到穿梭載體上。

通過電轉(zhuǎn)化方法，成功地將穿梭載體pHTss10304轉(zhuǎn)入到宿主菌Bt中，獲得工程菌Bt24、工程菌Bt33、工程菌Bt34和工程菌Bt36。經(jīng)過分子鑒定證明，已經(jīng)成功地構(gòu)建了具有能夠抑菌和抗蟲雙重效果的工程菌，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Rojas－Avelizapa LI，Cruz－Camarillo R，Guerrero MI.Selection and characterization of a proteo－chitinolytic strain of Bacillus thuringiensis，able to grow in shrimp waste media［J］.World J Microbiol Biotechnol，1999，15：299－308.

［2］ 田穎川 王瑛.蘇云金桿菌δ－內(nèi)毒素基因在大腸桿菌中的克隆及表達(dá)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1989，5（1）：11－18.

［3］ Chen H，Teplitski M，Gao M，Robinson JB，Rolfe BG.Bauer WD Proteomic analysis of wild typeSinorhizobiummelilotiresponses toN－acyl homoserine lactone quorum sensing signals［J］.J Bacteriol，2001，185：5029－5036.

［4］ Fuqua C，Parsek MR.Greenberg EP Regulation of gene expression by cell－to－cell communication：acyl－h(huán)omoserine lactone quorum sensing［J］.Annu Rev Genet，2003，35：439－468.

［5］ Birnboim，H.C.A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA［J］.Methods Enzymol，1983，100，243－255.

［6］ 《分子克隆試驗(yàn)指南》（第三版）［M］.科學(xué)出版社，2003.