朱慧 王彬 付雷 劉誠誠 陸宇

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病，每年約有新發(fā)患者800萬例，200萬例死于結(jié)核病[1]?？菇Y(jié)核藥物一般聯(lián)合應(yīng)用，以應(yīng)對結(jié)核分枝桿菌各亞群。吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是合成的煙酰胺的類似物，在單獨(dú)給藥時，殺菌活性很弱，但與利福平及幾種新藥合用時，有顯著的協(xié)同效應(yīng)[2]。作為WHO和國際防癆與肺部疾病聯(lián)合會(IUATLD)推薦的6種主要抗結(jié)核藥物之一，DOTS方案中添加PZA可以縮短療程并降低結(jié)核病復(fù)發(fā)率[3-4]。

吡嗪酰胺在每日給藥及間歇給藥方案中所用劑量是不同的。WHO推薦劑量是：1次/d給藥，15～30 mg/kg；間歇用藥時，3次/d給藥，25～35 mg/kg[5-7]。然而，在中國大部分地區(qū)，吡嗪酰胺的給藥方式是2～3次/d[8-9]。國內(nèi)的一些醫(yī)生已經(jīng)注意到不同地區(qū)吡嗪酰胺給藥頻率的不同[10-11]，建議通過大規(guī)模臨床試驗(yàn)評價1次/d給藥和3次/d給藥的效果，以規(guī)范吡嗪酰胺的合理有效應(yīng)用。

相比于每天數(shù)次給藥，1次/d的給藥方式通常認(rèn)為可以提高患者的依從性。然而，在國內(nèi)，吡嗪酰胺的耐受性問題使得普遍采用3次/d的給藥方式。本研究在小鼠模型上比較吡嗪酰胺1次/d給藥和3次/d給藥的藥代動力學(xué)差別，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器設(shè)備

1.實(shí)驗(yàn)用鼠來源：150只雄性BALB/c小鼠，平均體質(zhì)量(18±2)g，小鼠均為6周齡，購于維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司，所有動物實(shí)驗(yàn)符合動物倫理學(xué)要求。

2.實(shí)驗(yàn)所用試劑：藥物標(biāo)準(zhǔn)品異煙肼(INH，產(chǎn)品編號：117k0719)、利福平(RFP，產(chǎn)品編號： 1000948933)、吡嗪酰胺(PZA，產(chǎn)品編號：157640250)均購于Sigma公司。藥物均為粉末狀，-20 ℃冰箱保存，臨用前溶于5%羧甲基纖維素鈉溶液中給小鼠灌胃。

安捷倫高壓液相系統(tǒng)(安捷倫公司，美國)配備G1329A ALS模塊和柱加熱器(G1316A)，6410B三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜，電噴霧電離質(zhì)譜源(ESI)，數(shù)據(jù)采集及處理軟件G3335AA-MASSHUNTER_ software-78。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．設(shè)計和分組： 150只小鼠按編號法隨機(jī)分為5組(表1)。每組30只，灌胃給藥(給藥前小鼠禁食以避免食物干擾)。組1給予吡嗪酰胺1次/d，組2給予吡嗪酰胺3次/d，組3給予異煙肼和利福平，組4和5同時給予吡嗪酰胺、異煙肼和利福平(組3給予異煙肼和利福平1次/d，組4給予吡嗪酰胺、異煙肼和利福平1次/d，組5給予吡嗪酰胺3次/d、異煙肼和利福平1次/d，具體見表1)。3種藥物劑量均按人體劑量換算后，對應(yīng)的小鼠劑量為異煙肼25 mg/kg，利福平20 mg/kg，吡嗪酰胺150 mg/kg(實(shí)驗(yàn)設(shè)計以1 d藥物總劑量相同為前提)。

2．小鼠血樣品的留取和處理：小鼠給予6個藥物劑量(即給藥6 d后)后24 h，每組取3只小鼠(由操作者在各組內(nèi)按編號法隨機(jī)抓取3只血樣作為0 h 樣品；給予第7次劑量(按表1給藥，即第7天給藥之后取血)后每組3只小鼠在0.25、0.5、1、2、4、6、8 h分別眼眶取血作為各時間點(diǎn)樣品。血樣前處理方法簡述如下：50 μl血清樣品加入100 μl乙腈沉淀蛋白，混合后渦旋振蕩器振蕩20 s,離心(13 000×g，10 min)。取100 μl上清液，37 ℃吹氮?dú)飧稍?氮?dú)飧稍飪x)，再加入200 μl流動相(流動相在液質(zhì)聯(lián)用檢測部分有詳細(xì)說明，因?yàn)闄z測不同藥物時有不同流動相配比，此處用流動相泛指，檢測時按體積配比，不需測定pH值)溶解。

表1 各組小鼠實(shí)驗(yàn)給藥劑量與給藥頻次

注“-”：此組小鼠不使用此藥物；實(shí)驗(yàn)設(shè)計以1 d藥物總劑量相同為前提

小鼠灌胃給藥6個劑量后，每組3只小鼠在0.25、0.5、1、2、4、6、8 h取血，檢測血藥濃度；圖中每點(diǎn)表示3只小鼠血藥濃度的分別代表組1、組2、組4和組5中的吡嗪酰胺濃度圖1 吡嗪酰胺單用(組1、2)或聯(lián)合異煙肼-利福平(組4、5)給藥時吡嗪酰胺在小鼠體內(nèi)的AUC

小鼠肺樣本的留取和處理：小鼠給予6個藥物劑量后24 h，每組3只小鼠眼眶取血后，解剖，肺組織勻漿作為0 h樣品；給予第7次劑量后每組3只小鼠在0.5、2、4 h分別取肺作為各時間點(diǎn)樣品。肺樣本處理：全肺稱重后，加入甲醇用勻漿機(jī)勻漿，離心(13 000×g，10 min)取上清。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合檢測肺樣本方法和血樣基本一致。

3．液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合檢測藥物濃度：吡嗪酰胺和異煙肼的濃度檢測使用色譜柱ZORBAX SB-aq (2.1 mm×100 mm)，利福平的濃度檢測使用ZORBAX SB C-18 (2.1 mm×50 mm)柱，柱溫25 ℃。流動相A為含0.1%甲酸和5 mmol甲酸胺的去離子水溶液，流動相B為100%純乙腈，流動相C為含0.1%甲酸的去離子水溶液。檢測吡嗪酰胺和異煙肼時使用體積百分比為92%的A和8%的B為流動相，利福平使用體積百分比為60%的B和40%的C為流動相，流率0.3 ml/min。進(jìn)樣量2 μl。多重離子監(jiān)測(MRM)分別為，PZA：124.1→81.1質(zhì)荷比(m/z)；INH：138.2→121.0 m/z；RFP：823.2→791.3 m/z。

用去離子水配制吡嗪酰胺1 mg/ml和異煙肼0.4 mg/ml儲備液，利福平溶于50%甲醇水溶液中配制成0.4 mg/ml儲備液。用去離子水配制的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)藥物溶液，通過在空白血清中加入不同體積的藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到同時含有吡嗪酰胺和異煙肼的不同溶液，吡嗪酰胺/異煙肼分別為10/0.1、20/0.2、40/1.0、50/2.0、100/4.0、200/10 μg/ml(10/0.1是指1份同時含有10 μg/ml吡嗪酰胺和0.1 μg/ml異煙肼的小鼠血清樣品，其他以此類推)，利福平為0.2、0.4、1、4、10、20、28 μg/ml，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法有效性及特異性已檢測[12]，空白血清無干擾，線性范圍[12]分別為利福平0.1～40 μg/ml (r2=0.999), 異煙肼0.1～10 μg/ml (r2=0.998)，吡嗪酰胺0.1～10 μg/ml (r2=0.999), 10～200 μg/ml (r2=0.995)。

4.質(zhì)量控制：具體方法的精密度、重現(xiàn)性等方法學(xué)已經(jīng)考證[13]，空白血樣采自未給藥小鼠，同一小鼠血樣分2份，一份檢測利福平，另一份同時檢測吡嗪酰胺和異煙肼。

三、結(jié)果的判讀和統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1.不同給藥方式中吡嗪酰胺的主要藥代動力學(xué)參數(shù)：如圖1所示，小鼠灌胃單獨(dú)給予吡嗪酰胺后，1次/d給藥時平均峰濃度Cmax為(155.3±5.1)μg/ml，3次/d給藥時為(43.2±2.6)μg/ml；相應(yīng)的8 h內(nèi)藥時曲線下面積AUC0～8 h值分別為269.5和70.9 mg·h/L。當(dāng)同時給予異煙肼和利福平時，吡嗪酰胺平均峰濃度Cmax1次/d給藥時為(151.8±17.3)μg/ml，3次/d給藥時為(45.1±1.0)μg/ml；相應(yīng)的AUC0～8 h值分別為383.1和81.0 mg·h/L(表2)。圖1顯示了無論聯(lián)用異煙肼-利福平與否，吡嗪酰胺的Cmax及AUC0～8 h值在1次/d給藥時明顯高于3次/d的給藥，組1與組2(t=27.71，P<0.01)；組4與組5(t=8.718，P<0.05)。

表2 吡嗪酰胺、利福平和異煙肼的藥代動力學(xué)參數(shù)

小鼠灌胃給藥6個劑量后，每組3只小鼠在0.25、0.5、1、2、4、6、8 h取血，檢測異煙肼血藥濃度；圖中每點(diǎn)表示3只小鼠血藥濃度的分別代表組3、組4和組5中的異煙肼濃度圖2 異煙肼-利福平合用(組3)或聯(lián)合吡嗪酰胺(組4、5)給藥時異煙肼在小鼠體內(nèi)的AUC

2．吡嗪酰胺不同給藥方式時利福平的藥代動力學(xué)參數(shù)變化：當(dāng)利福平-異煙肼與150 mg/kg吡嗪酰胺聯(lián)用時，對比于組3，吡嗪酰胺1次/d時(組4)輕微升高利福平的Cmax，降低Tmax和T1/2，AUC0～8 h無變化；吡嗪酰胺3次/d時(組5)則顯著降低利福平的Cmax(t=6.181，P<0.05)，Tmax和AUC0～8 h，升高T1/2(表2)。

3．吡嗪酰胺不同給藥方式時異煙肼的藥代動力學(xué)參數(shù)變化：當(dāng)異煙肼、利福平和吡嗪酰胺三藥聯(lián)用時，吡嗪酰胺1次/d給藥方案并不影響異煙肼的Cmax, T1/2(半衰期)和AUC0～8 h(組3)，但吡嗪酰胺3次/d給藥時(組5)則顯著降低了異煙肼的Cmax和AUC0～8 h(相比于組3，Cmax組間t檢驗(yàn)，t=9.499，P<0.01)，同時使異煙肼的Tmax從0.25 h延長到0.5 h(圖2，表2)。

4．小鼠肺中藥物濃度：小鼠給藥0.5、2、4 h后檢測小鼠肺內(nèi)異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的濃度。對于吡嗪酰胺，四組小鼠肺組織濃度(μg/g)和血清藥物濃度(μg/ml)均近似。異煙肼肺濃度(組3、4)為相同時間點(diǎn)血藥濃度的1/2，而組5中異煙肼肺濃度極低而檢測不到。三組小鼠中利福平肺濃度為相同時間點(diǎn)血藥濃度的1/3～1/4(表3)。

表3 不同組別的3種藥物在肺組織和血中不同時間點(diǎn)的濃度

討 論

本研究在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了吡嗪酰胺1次/d和3次/d給藥的藥代動力學(xué)比較，所用異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的劑量相當(dāng)于人體內(nèi)同等劑量[7]。結(jié)果表明，無論是否聯(lián)用利福平和異煙肼，PZA的Cmax和AUC0～8 h在1次/d給藥方案中至少是3次/d給藥時的3.5倍。正如Hall等[14]提到，吡嗪酰胺是AUC∶MIC比例驅(qū)動抗生素，AUC在吡嗪酰胺的抗結(jié)核效果中是一項(xiàng)重要的參數(shù)。基于此點(diǎn)，吡嗪酰胺1次/d給藥方案優(yōu)于3次/d。與異煙肼、利福平聯(lián)用時，吡嗪酰胺3次/d給藥降低了異煙肼、利福平的Cmax及AUC0～8 h，1次/d給藥則沒有，這表明當(dāng)與異煙肼、利福平聯(lián)用時，吡嗪酰胺3次/d給藥會對異煙肼、利福平在藥代動力學(xué)上產(chǎn)生拮抗效應(yīng)，尤其是對異煙肼，而這是在抗結(jié)核治療中不希望看到的。Grosset等[15]的研究也表明，小鼠體內(nèi)，異煙肼和吡嗪酰胺-利福平存在拮抗作用，機(jī)理尚不清楚。

部分國內(nèi)醫(yī)生認(rèn)為，吡嗪酰胺1次/d給藥可能會引起更多的肝毒性。但迄今為止，并沒有科學(xué)研究報告支持這一說法。根據(jù)Sharma等[16]的研究，吡嗪酰胺給藥方案和肝毒性之間并無相關(guān)性。吡嗪酰胺在25 mg·kg-1·d-1或更低劑量時，并不產(chǎn)生相關(guān)的肝毒性，在20世紀(jì)50年代開始應(yīng)用吡嗪酰胺時有較高的肝毒性(11%～14%)報告，但當(dāng)時吡嗪酰胺每日劑量達(dá)40～70 mg/kg[12]。由于肝毒性的產(chǎn)生是藥物蓄積的過程，在本實(shí)驗(yàn)中，未能同時檢測肝毒性。

吡嗪酰胺在治療初期的開始2個月可以殺死緩慢生長的結(jié)核分枝桿菌，是對抗持留菌最有效的藥物[17]。近期國內(nèi)對345例復(fù)治肺結(jié)核患者進(jìn)行化療方案比較時，化療新方案及原方案中均含有吡嗪酰胺[18]。初始治療階段吡嗪酰胺推薦劑量是15～30 mg/kg (最大不超過2 g)，而國內(nèi)大部分給藥方案是500 mg/次，3次/d，本研究至少在藥代動力學(xué)方面并不支持這一方案。

相關(guān)PK-PD研究早已表明藥物不同劑量及給藥方案可以優(yōu)化治療及縮短療程，通過調(diào)整給藥方案可以更好地升高血藥濃度達(dá)到藥物治療范圍。通過針對個體體質(zhì)量優(yōu)化劑量可以達(dá)到療效最大化及毒性最小化。建議對于可耐受的患者給予吡嗪酰胺1次/d方案。限于本研究僅從藥代動力學(xué)的角度以及給藥方案的局限和實(shí)驗(yàn)規(guī)模，還需要從藥效學(xué)方面進(jìn)一步尋找吡嗪酰胺1次/d和3次/d給藥的依據(jù)，以期能夠?yàn)楦雍侠淼貞?yīng)用吡嗪酰胺提供理論依據(jù)。

[1] World Health Organization. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 Global report on surveillance and response. Geneva：World Health Organization，2010：18.

[2] Davies GR, Nuermberger EL. Pharmacokinetics and pharmacodynamics in the development of anti-tuberculosis drugs. Tuberculosis (Edinb),2008, 88 Suppl 1: S65-S74.

[3] 黃正明, 胡克章. 肺結(jié)核的藥物治療現(xiàn)狀與抗結(jié)核藥的合理應(yīng)用.醫(yī)藥導(dǎo)報, 2008,27 (3):250-252.

[4] 沙巍, 肖和平.未來理想的抗結(jié)核藥物與化學(xué)治療方案. 中國防癆雜志, 2012, 34 (11): 693-695.

[5] Arya DS, Ojha SK, Semwal OP, et al. Pharmacokinetics of pyrazinamide in children with primary progressive disease of lungs. Indian J Med Res,2008, 128(5): 611-615.

[6] Donald PR, Maritz JS, Diacon AH. Pyrazinamide pharmacokinetics and efficacy in adults and children. Tuberculosis (Edinb),2012, 92 (1): 1-8.

[7] Ahmad Z, Nuermberger EL, Tasneen R, et al. Comparison of the ‘Denver regimen’ against acute tuberculosis in the mouse and guinea pig. J Antimicrob Chemother, 2010, 65 (4): 729-734.

[8] 周曉映, 原淑鴻, 張紅漫. 吡嗪酰胺的不良反應(yīng)概述. 中國藥房, 2008, 19 (5): 388-389.

[9] 黃仕聰,孫強(qiáng). 抗結(jié)核藥所致肝損害46例. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2001, 20 (7): 454-454.

[10] 李秀麗,楊武軍. 吡嗪酰胺臨床給藥方法. 中國廠礦醫(yī)學(xué), 2009, 22 (2):225-225.

[11] 嚴(yán)舒俊. 試談抗結(jié)核藥物口服劑型的正確用法.中華結(jié)核和呼吸雜志,2007,30 (6): 477.

[12] 朱慧,李芃,陸宇.LC-MS/MS 方法同時檢測人血漿中異煙肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的濃度. 藥物分析雜志, 2012, 32 (6): 11-15.

[13] Xu J, Jin HX, Zhu H, et al. Oral bioavailability of rifampicin, isoniazid, ethambutol and pyrazinamide in a 4-drug fixed-dose combination compared with the separate formulations in healthy Chinese male volunteers. Clin Thera, 2013, 35 (2): 161-168.

[14] Hall RG, Leff RD, Gumbo T. Treatment of active pulmonary tuberculosis in adults: current standards and recent advances: insights from the society of infectious diseases pharmacists. Pharmacotherapy, 2009, 29 (12): 1468-1481.

[15] Grosset J, Truffot-PernotC, Lacroix C, et al. Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifampin against tuberculosis infection in mice. Antimicrob Agents Chemother, 1992, 36 (3): 548-551.

[16] Sharma SK, Singla R, Sarda P, et al. Safety of 3 different reintroduction regimens of antituberculosis drugs after development of antituberculosis treatment-induced hepatotoxicity. Clin Infect Dis, 2010, 50 (6): 833-839.

[17] Lounis N, Veziris N, Chauffour A, et al. Combinations of R207910 with drugs used to treat multidrug-resistant tuberculosis have the potential to shorten treatment duration.Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50 (11): 3543-3547.

[18] 朱莉貞,高孟秋,陳巍,等.復(fù)治肺結(jié)核化療新方案與原復(fù)治方案的臨床對照研究.中國防癆雜志,2012, 34 (5): 304-309.