劉錫紅，趙靈希，張成杰，劉 虹，覃 瑞，熊海容，*

（1.中南民族大學(xué)南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護(hù)及綜合利用工程中心，湖北武漢430074；2.武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司，湖北武漢430000）

目前工業(yè)化生產(chǎn)甲殼素的原料主要是蝦、蟹殼，2006年我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量已高達(dá)156×104t左右，目前我國(guó)的對(duì)蝦產(chǎn)品主要以出口為主，而出口產(chǎn)品又以無(wú)頭對(duì)蝦（蝦仁）為主。對(duì)蝦的蝦頭和蝦殼占整個(gè)蝦質(zhì)量的30%～40%，在對(duì)蝦的加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的蝦頭和蝦殼下腳料[1]。目前工業(yè)上去除蝦殼中蛋白質(zhì)的主要方法是采用稀NaOH溶液熬煮蝦殼，熬煮液經(jīng)HCl中和后回收其中的蛋白質(zhì)，固體物質(zhì)經(jīng)KMnO4氧化，再用NaHSO3還原，水洗干燥得到甲殼素[2-4]。采用這一方法，堿液及熱能消耗大，易產(chǎn)生廢液廢水，環(huán)境污染嚴(yán)重，雖可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的回收利用，但利用率和價(jià)值都較低，工序復(fù)雜[5]。采用酶法脫蛋白可降低有機(jī)試劑的用量，縮短提取時(shí)間，效果比常規(guī)方法好，而且酶法脫蛋白化學(xué)試劑用量少，蛋白質(zhì)回收容易。如果采用蛋白酶水解的方式脫除蝦殼中的蛋白質(zhì)，不僅條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，廢水廢液少，而且可實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排，因此是一種值得研究和推廣的綠色加工技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白酶去除蛋白質(zhì)收獲甲殼素，避免了堿法對(duì)環(huán)境造成的污染。蝦頭和蝦殼中殘留有大量的蛋白質(zhì)，另外還有多不飽和脂肪酸、VE、蝦青素和各種礦物質(zhì)等成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。利用蛋白酶水解蝦頭和蝦殼，可以將其中的蛋白質(zhì)水解為短肽、氨基酸等，所得水解液經(jīng)噴霧干燥可制成蛋白粉，或者經(jīng)調(diào)配制成蝦油[1]。本論文采用不同蛋白酶水解脫鈣蝦殼，研究了酶解的條件及酶解對(duì)甲殼素微觀表面狀態(tài)的影響，選出最合理的蛋白酶及其水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦殼 購(gòu)自浙江海鮮市場(chǎng)，經(jīng)過(guò)挑選除雜、清洗和干燥后，粉碎混勻，儲(chǔ)藏備用；標(biāo)準(zhǔn)甲殼素樣品Sigma公司，色譜純；堿性蛋白酶、酸性蛋白酶 源葉生物；胰蛋白酶、木瓜蛋白 BIOSHARP公司；NaOH（分析純）、硼酸（化學(xué)純）、硼砂（化學(xué)純） 國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；福林酚試劑 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；干酪素 源葉生物；L-酪氨酸 Sigma公司；其他化學(xué)藥品 均為分析純。

RK1028型超聲波清洗儀 德國(guó)BANDELIN公司；JA2003型電子分析天平 HANGPING公司；722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) UNICO公司；半微量凱氏定氮儀 上海申立儀器有限公司；低溫超高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；jsm6510型電子掃描顯微鏡 日本；E-1010型離子濺射儀 HITACHI；粉碎機(jī) 上海速邦。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 酶法改良甲殼素制備工藝流程：蝦殼→預(yù)處理→稀鹽酸脫碳酸鹽→水洗至中性→蛋白酶脫除蛋白質(zhì)→水洗至中性→干燥→脫色→甲殼素。

1.2.2 操作步驟

1.2.2.1 預(yù)處理 蝦殼經(jīng)分檢去雜后浸入40℃溫水15min，去除雜質(zhì)，撈取蝦殼用清水反復(fù)沖洗至無(wú)浮液并瀝干待用。

1.2.2.2 烘干 將清洗好的蝦殼置于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，干燥溫度為80℃，時(shí)間8h。

1.2.2.3 粉碎 對(duì)達(dá)到干燥要求的蝦殼，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎至所需粒度。

1.2.2.4 稀鹽酸脫碳酸鹽 將烘干的蝦殼用0.25mol/L HCl在室溫下攪拌處理30min[6]。

1.2.2.5 酶解 將蝦殼和蒸餾水加入玻璃容器里，用2%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至蛋白酶最適pH，再加入蛋白酶粉，水浴鍋預(yù)熱至蛋白酶最適溫度，在恒溫?cái)嚢杵鞯臈l件下進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.3 酶活力的測(cè)定 采用Folin顯色法[7]，測(cè)OD680nm值并計(jì)算酶活力。酶活定義為1g固體酶粉（或1mL液體酶），在一定溫度和pH條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位，以U/g（U/mL）表示。

1.2.4 蝦殼常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4.1 水分測(cè)定 采用105℃恒重法[8]。

1.2.4.2 脂肪含量的測(cè)定 采用索氏抽提法測(cè)定[9]。

1.2.4.3 灰分含量的測(cè)定 采用550℃干法灰化法測(cè)定[10]。

1.2.4.4 甲殼素化學(xué)制備方法 稱取10g蝦殼粉，用5%鹽酸溶液浸泡至無(wú)氣泡產(chǎn)生，洗滌至中性，烘干，用10%氫氧化鈉在沸水浴中浸泡1～2h，洗滌至中性，烘干。其中脫蛋白與脫鈣處理重復(fù)2～3次。進(jìn)行脫色，得到白色甲殼素，稱取質(zhì)量[11]。

1.2.4.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 稱取5g粉碎的蝦殼，加人30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，于溫度95℃下水浴浸泡60min，離心分離，濾渣重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，合并上清液，用凱氏定氮法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量[1]。

1.2.5 樣品總氮含量的測(cè)定 采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量[12]。

1.2.6 蛋白質(zhì)水解率的測(cè)定 公式如下：

式中：X-試樣中蛋白質(zhì)的水解率；A-原材料蝦殼中的總氮；B-酶法水解后收獲物的總氮；C-酸堿法水解蝦殼獲得的甲殼素的總氮。

1.2.7 水解用蛋白酶的選擇 分別采用堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶水、胰蛋白酶解粉碎成20目蝦殼，加酶量10000U/g，在酶的最適反應(yīng)條件（見(jiàn)表1）下反應(yīng)5h，底物質(zhì)量濃度為2g/100mL，比較四種酶的水解率大小。

表1 酶的最適反應(yīng)溫度、pHTable 1 The optimal temperature and pH of enzymes

1.2.8 酶解時(shí)間的選擇 加水到粉碎成20目的蝦殼中，底物質(zhì)量濃度為2g/100mL，添加堿性蛋白酶5000U/g，于溫度60℃保溫水解24h，pH為8.5，反應(yīng)過(guò)程中分別在第2、3、4、5、6、7、10、24h取樣測(cè)定其水解率。

1.2.9 酶用量的選擇 加入水到粉碎成20目的蝦殼中，底物濃度為2g/100mL，堿性酶用量分別為2000、3000、4000、5000、6000、7000U/g，于溫度60℃保溫水解5h，pH為8.5，反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定水解率。

1.2.10 最佳底物濃度的選擇 加不同量的水到粉碎成20目的蝦殼中，使底物質(zhì)量濃度分別為1、2、2.5、3、3.5g/100mL，添加堿性蛋白酶5000U/g，于溫度60℃保溫水解5h，pH為8.5，反應(yīng)結(jié)束測(cè)定水解度。

1.2.11 蝦頭、蝦殼殼破碎粒度的選擇 將蝦殼分別粉碎成過(guò)20目篩、過(guò)40目篩和過(guò)80目篩，底物質(zhì)量濃度為2g/100mL，加入5000U/g堿性蛋白酶，于溫度60℃保溫水解5h，pH為8.5，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定水解率。

1.2.12 脫色方法 將前述工藝所得的蝦殼在3%KMnO4溶液中，固液比為1∶10，常溫下處理0.5h，后換用1%草酸溶液，固液比為1∶20，在70℃水浴中處理15min或常溫下處理5h[13]。

1.2.13 甲殼素的表征與特性分析 采用jsm6510-EDAX（日本）電子掃描顯微鏡對(duì)甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品、化學(xué)法甲殼素樣品和酶法甲殼素樣品表征進(jìn)行檢測(cè)。用HITACHI E-1010離子濺射儀在觀察面上鍍金后，在3000倍數(shù)下對(duì)試樣甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品、化學(xué)法甲殼素樣品和酶法甲殼素樣品進(jìn)行表面形貌的觀察[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦殼基本成分

經(jīng)測(cè)定，蝦殼中各成分含量為：水分6.4%，粗蛋白40.9%，粗脂肪7.2%，灰分11.7%，其余部分主要為甲殼素。

2.2 酶活力的測(cè)定結(jié)果

4種蛋白酶酶活力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 酶活力測(cè)定結(jié)果Table 2 The results of enzyme activity

由表1可知，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活力相對(duì)較低，堿性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶活力都比較高。

2.3 蛋白酶的確定

4種酶的水解率見(jiàn)圖1。

圖1 酶種類對(duì)水解率的影響Fig.1 The effect of different kinds of enzyme on hydrolysis rate

由圖1可知，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果最差，水解率相對(duì)較低，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解效果最好，水解率都比較高。考慮到堿性蛋白酶的水解率略高于胰蛋白酶，而且胰蛋白酶的價(jià)格昂貴，且綜合表1結(jié)果的堿性蛋白酶的酶活力相對(duì)較高，選擇堿性蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.4 酶解條件的確定

2.4.1 酶解時(shí)間的確定 酶解時(shí)間對(duì)水解效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.2 The effect of time on hydrolysis rate

由圖2可知，酶解液的水解率隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，在前2h增長(zhǎng)速度極快，酶解到第7h反應(yīng)便逐漸趨于平衡，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，水解率增加較少，考慮到生產(chǎn)效率問(wèn)題，選擇酶解時(shí)間6h為宜。

2.4.2 酶用量的確定 酶用量對(duì)酶解效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶用量對(duì)酶解效果的影響Fig.3 The effect of enzyme dosage on hydrolysis rate

由圖3可知，堿性蛋白酶用量在2000～7000U/g的情況下，隨著酶用量的增加，酶解液的水解率逐漸增大，當(dāng)堿性蛋白酶用量超過(guò)5000U/g后，水解效果提高并不明顯，因此，從減少成本的角度考慮，選擇采用堿性蛋白酶用量為5000U/g。

2.4.3 最佳底物質(zhì)量濃度的確定 最佳底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解效果的影響Fig.4 The effect of concentration of substrate on hydrolysis rate

由圖4可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，水解率也增大，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為2.0g/100mL時(shí)，水解效果趨于平衡，當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?.0g/100mL時(shí)，對(duì)水解率產(chǎn)生一定的影響。但在生產(chǎn)中采用高底物濃度使得單位時(shí)間和單位容積的反應(yīng)器收得量更高，因此實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可以選擇3.0～3.5g/100mL的底物質(zhì)量濃度，本實(shí)驗(yàn)則選用2.0g/100mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4.4 蝦殼破碎粒度的確定 蝦殼破碎粒度對(duì)酶解效果的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，過(guò)80目篩的蝦殼水解效果最好，但三個(gè)破碎度之間的水解率差異不顯著（p＞0.05），從后期處理的簡(jiǎn)化考慮，選擇過(guò)20目篩的蝦殼進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 脫色效果

甲殼素的脫色，主要是將甲殼素的顏色去除，使甲殼素顏色變淺，提高產(chǎn)品價(jià)值。在脫色前，甲殼素不宜粉碎成較小顆粒，以免被氧化降解，形成更小顆粒或細(xì)粉末狀，影響產(chǎn)物回收率，降低得率[15]。

將脫鈣和脫蛋白質(zhì)后的蝦殼在分別經(jīng)過(guò)3%KMnO4溶液和1%草酸溶液處理。實(shí)驗(yàn)顯示脫色效果良好，所得甲殼素蓬松，色澤半透明，且白晳、均一。

圖5 蝦殼破碎粒度對(duì)酶解效果的影響Fig.5 The effect of particle size on hydrolysis rate

2.6 甲殼素的表征與特性分析

根據(jù)Gershecker[16]的工作及研究表明，甲殼由表殼層、外殼層、含鈣內(nèi)殼層及非含鈣內(nèi)殼層組成。真皮層位于含鈣內(nèi)殼層內(nèi)，真皮層內(nèi)的色素細(xì)胞分泌黑色素。表殼層由酚類、脂肪、蛋白質(zhì)所組成的薄膜狀結(jié)構(gòu)，在甲殼體表面起到類似涂層的保護(hù)作用[15]。

本研究比較了脫鈣后蝦殼經(jīng)化學(xué)法脫蛋白及采用堿性蛋白酶水解蛋白后的電鏡照片，并與甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖6～圖8。

圖6～圖7分別為甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品和傳統(tǒng)化學(xué)工藝制備的甲殼素的掃描電鏡圖，從圖中可知，脫蛋白后，樣品表面較為光滑，說(shuō)明蛋白質(zhì)、鈣和脂肪已被基本除去，剩下的主要為甲殼素。圖8為酶法改良工藝制備的甲殼素的掃描電鏡圖，可以看到甲殼素的組織結(jié)構(gòu)，表面為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，圖中白點(diǎn)應(yīng)是真皮層內(nèi)的色素細(xì)胞分泌出的色素顆粒，表面很平整，說(shuō)明蛋白質(zhì)、脂肪和鈣已基本被除去。比較從三種甲殼素的掃描電鏡照片，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)采用的由蝦殼制備甲殼素的工藝是合理的。

圖6 甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品電鏡掃描圖（×3000）Fig.6 SEM photographs of chitin standard substance（×3000）

圖7 化學(xué)法甲殼素樣品電鏡掃描圖（×3000）Fig.7 SEM photographs of chitin samples from chemical method（×3000）

圖8 酶法甲殼素樣品電鏡掃描圖（×3000）Fig.8 SEM photographs of chitin samples from enzyme method（×3000）

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

向粉碎成20目的蝦殼中加入5000U/g的堿性蛋白酶，底物質(zhì)量濃度為2g/100mL，pH為8.5，于溫度60℃保溫水解6h，在此條件下，水解率達(dá)到78.3%。

3 討論

一直以來(lái)，甲殼素的制備工藝以化學(xué)方法為多，化學(xué)方法雖然試劑易得，但是存在反應(yīng)條件劇烈、設(shè)備要求高、產(chǎn)品質(zhì)量差、容易造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)。而采用酶法脫蛋白可降低試劑的用量，縮短提取時(shí)間，效果比化學(xué)方法好，而且酶法脫蛋白化學(xué)試劑用量少，蛋白質(zhì)容易回收。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還可以將其中的蛋白質(zhì)水解為短肽、氨基酸等，將所得水解液經(jīng)噴霧干燥制成蛋白粉，或者經(jīng)調(diào)配制成蝦油。進(jìn)一步分析蝦殼蛋白質(zhì)水解液的多肽成分和多肽含量也是非常有價(jià)值的工作。

如果直接采用凱氏定氮法測(cè)定蝦殼和蝦頭中蛋白質(zhì)是不合理的，因?yàn)槲r殼中含有大量的甲殼素，而甲殼素中含有豐富的氮，如果直接將其消化后測(cè)定，則甲殼素中的氮也被計(jì)算到蛋白質(zhì)中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)測(cè)定值嚴(yán)重偏離實(shí)際含量。還有一些實(shí)驗(yàn)通過(guò)甲醛法測(cè)定氨基態(tài)氮的含量來(lái)測(cè)定水解度，由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要監(jiān)測(cè)體系pH的變化，較為繁瑣復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)首先用凱氏定氮法分別測(cè)定蝦殼中總氮含量和用化學(xué)法制得的甲殼素中總氮的含量，再對(duì)酶法制備的甲殼素進(jìn)行總氮含量的測(cè)定，通過(guò)1.2.6中的公式進(jìn)行水解率的計(jì)算，從而既避免了甲殼素氮對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定量的影響，又簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。

4 結(jié)論

甲殼素是一種資源豐富，而且是存在于自然界中的唯一一種帶陽(yáng)離子能生物降解的高分子材料，甲殼素及其衍生物具有不污染環(huán)境、物理化學(xué)性質(zhì)和生物特征優(yōu)異的特點(diǎn)，在化工、紡織、印染、造紙、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、化妝品等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究表明，酶法去除蝦殼中蛋白質(zhì)的最佳條件為：向粉碎成20目的蝦殼中加入5000U/g的堿性蛋白酶，底物質(zhì)量濃度為2g/100mL，pH為8.5，于溫度60℃保溫水解6h，在此條件下，水解率達(dá)到78.3%。通過(guò)掃描電鏡分析測(cè)試，比較了甲殼素標(biāo)準(zhǔn)品、化學(xué)法甲殼素樣品和酶法甲殼素樣品的電鏡掃描照片，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)采用的由蝦殼制備甲殼素的工藝是合理的。

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