許琴，李建瑛，任秀梅，趙彥斌，胡仲明，許永華，孫兆增，劉一，劉文森

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122;2.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，烏魯木齊 830000;3.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部，長(zhǎng)春 130000;4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071)

比格犬原產(chǎn)于英國(guó)，是一種小型獵犬，現(xiàn)為國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)犬。犬排卵發(fā)生在第一次減數(shù)分裂開始時(shí)，排卵后不久生發(fā)泡發(fā)生破例，卵子在輸卵管內(nèi)經(jīng)1～3d發(fā)育至成熟，而大多數(shù)哺乳動(dòng)物排出的卵母細(xì)胞已經(jīng)成熟［1］，因此犬的輔助生殖研究進(jìn)展緩慢，仍有許多技術(shù)問題未得到解決。雌激素通過其受體在靶器官內(nèi)發(fā)揮生殖調(diào)控及生理病理功能，雌激素受體(estrogen receptors，ER)是核受體超家族成員，雌激素受體有兩個(gè)亞型:即ERα和ERβ，人的ERα于1986年由法國(guó)學(xué)者 Chambon首次克隆出［2］，1996年 Mosselman和Kuiper分別從人和大鼠組織中克隆出了第二種雌激素受體亞型并將其命名為 ERβ［3，4］。ERα 與 ERβ 在人、大鼠、小鼠研究的比較多，尤其在雌激素依賴性生殖系統(tǒng)疾病方面的研究已經(jīng)相當(dāng)深入，在牛、羊、豬、犬、雞、魚類上也有研究，但大多集中于兩種雌激素受體基因的mRNA表達(dá)方面［5－8］。研究表明 ERα 和 ERβ 的氨基酸序列和基因序列有很高的同源性，但 ERα/ERβ組織學(xué)分布不同，參與了不同器官的生理和病理作用。本文在前期對(duì)比格犬發(fā)情期與間情期卵巢與子宮正常組織形態(tài)比較研究的基礎(chǔ)上，對(duì)兩種雌激素受體在這兩種組織中的表達(dá)做進(jìn)一步分析，以期為兩種受體在比格犬生殖內(nèi)分泌調(diào)控中的作用做初步的探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

經(jīng)產(chǎn)比格母犬6只，20～22 kg，其中經(jīng)血清學(xué)、行為學(xué)、外觀體征確定為發(fā)情期的兩只，處于間情期的4只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK－(軍)2007－001】，無(wú)菌手術(shù)在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行【SYXK－(軍)2007－005】，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

萊卡切片機(jī)(德國(guó))，Olympus顯微鏡(日本)，BI2000圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟)，37℃恒溫箱(北京六一儀器廠)，組化孵育濕盒(福州邁新)。

萊卡包埋石蠟，即用型免疫組織化學(xué)超敏UltraSensitiveTMSP 試劑盒 (產(chǎn)品編號(hào):KIT－9707)，DouSPTM免疫組化雙染試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):KIT－9999)，DAB 顯色劑(產(chǎn)品編號(hào):DAB－0031)，0.01 mol/L檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)，0.01 mol/L TBS(pH 7.2－7.4)，均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。兔抗人 ERα(H－184)多克隆抗體(sc－7207，Santa Cruz，美國(guó));兔抗大鼠 ERβ 多克隆抗體 (ab3577，Abcam，英國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比格犬按照發(fā)情期與間情期分組，經(jīng)鹽酸氯胺酮10～20 mg/(kg·bw)肌內(nèi)注射麻醉，無(wú)菌條件下取卵巢、子宮組織，記錄并標(biāo)明標(biāo)簽，4%多聚甲醛固定24～48 h，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，萊卡切片機(jī)切取 4 μm厚度組織，防脫片撈片，60℃烘烤過夜。

1.3.2 ERα、ERβ免疫組化染色

(1)UltraSensitiveTMSP免疫組化試劑盒 ERα、ERβ的單染:按照說明書進(jìn)行，一抗 ERα以 1∶100稀釋后使用，ERβ以1∶900稀釋后使用，DAB顯色。

(2)DouSPTM免疫組化雙染試劑盒 ERα、ERβ的雙染:按照說明書進(jìn)行操作，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一抗的上樣順序?yàn)橄壬?ERα，后上 ERβ，ERα用 BCIP/NBT顯色，ERβ，用 AEC顯色，水性封片劑封片。

(3)DouSPTM免疫組化雙染試劑盒ERα單染:按照ERα、ERβ雙染步驟進(jìn)行，其中ERβ用抗體稀釋液取代。

(4)DouSPTM免疫組化雙染試劑盒ERβ單染:按照ERα、ERβ雙染步驟進(jìn)行，其中ERα用抗體稀釋液取代。

以上操作中，陰性對(duì)照一抗均用抗體稀釋液取代。每種組織及不同的蛋白因子均至少做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 ERα、ERβ在比格犬卵巢內(nèi)的表達(dá)

ERα、ERβ在比格犬卵巢內(nèi)的表達(dá)(DAB顯色)見圖1。ERα主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞(圖1a)、卵巢間質(zhì)腺腺上皮細(xì)胞(圖1b)，定位于胞核，卵細(xì)胞核及卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)，ERα在卵泡膜內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞及小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)也有少量表達(dá)，同樣定位于胞核內(nèi)(圖1c)。ERα表達(dá)于膜黃體細(xì)胞的胞核內(nèi)(圖1d)，而在黃體顆粒細(xì)胞卻胞核與胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)(圖1e)。并且發(fā)情期與間情期兩個(gè)不同生理狀態(tài)時(shí)，ERα的表達(dá)量似存在差異。ERβ主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞(圖1f)，卵巢間質(zhì)腺的腺上皮細(xì)胞(圖1h)及顆粒黃體細(xì)胞(圖1f)，少量表達(dá)于卵巢間質(zhì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(圖1i)，均定位于胞質(zhì)。圖1見彩插2。

2.2 ERα、ERβ在比格犬子宮內(nèi)的表達(dá)

ERα、ERβ在比格犬子宮內(nèi)的表達(dá)(DAB顯色)見圖2。ERα主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞胞核內(nèi)(圖2a)，而ERβ主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞胞質(zhì)(圖2b)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)(圖2c)。圖2見彩插3。

2.3 ERα、ERβ在比格犬子宮內(nèi)的共表達(dá)

ERα、ERβ在比格犬子宮內(nèi)的共表達(dá)見圖 3。BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色更清楚地表現(xiàn)出ERα主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體腺上皮細(xì)胞胞核內(nèi)，而在腺體周圍的基質(zhì)細(xì)胞胞核內(nèi)也有表達(dá)(圖3a)。AEC過氧化物酶顯色與DAB顯色出現(xiàn)同樣的結(jié)果，ERβ主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，在腺體基質(zhì)中的血管上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)(圖3b)。BCIP/NBT與AEC雙染未見ERα、ERβ在子宮內(nèi)有明顯的共表達(dá)現(xiàn)象(圖3c)。圖3見彩插3。

注：a.間情期犬卵巢的ERα表達(dá)；b. 發(fā)情期犬卵巢間質(zhì)腺體的ERα表達(dá)；c. 卵巢ERα表達(dá)的陰性對(duì)照；d. 間情期犬黃體的ERα表達(dá)；e. 發(fā)情期犬黃體的ERα表達(dá)；f. 發(fā)情期犬黃體的ERβ表達(dá)；g. 間情期犬卵巢的ERβ表達(dá)；h. 發(fā)情期犬卵巢的ERβ表達(dá)；i. 發(fā)情期犬卵巢間質(zhì)內(nèi)動(dòng)脈的ERβ表達(dá)。圖1 ERα、ERβ在比格犬卵巢內(nèi)的表達(dá)（DAB顯色）Note: a. ERα expression in a diestrous canine ovary; b. ERα expression in the interstitial glands of an estrous canine ovary; c. Negative ERα expression in a control ovary; d. ERα expression in the corpus luteum of a diestrous canine ovary; e. ERα expression in the corpus luteum of an estrous canine ovary; f. ERβ expression in the corpus luteum of an estrous canine ovary; g. ERβ expression in a diestrous canine ovary; h. ERβ expression in an estrous canine ovary; i. ERβ expression in the arteries of an estrous canine ovary.Fig.1 Expression of ERα and ERβ in the canine ovaries

·2·

注：a. 間情期犬子宮內(nèi)膜的ERα表達(dá)；b. 發(fā)情期犬子宮內(nèi)膜的ERβ表達(dá)；c. 子宮內(nèi)膜間質(zhì)動(dòng)脈的ERβ表達(dá)。圖2 ERα、ERβ在比格犬子宮內(nèi)的表達(dá)（DAB顯色）Note: a. ERα expression in the endometrium of a diestrous canine uterus; b. ERβ expression in the endometrium of an estrous canine uterus; c. ERβ expression in the interstitial artery of the endometrium of a canine uterus.Fig.2 Expression of ERα and ERβ in the canines uterus

注：a.間情期犬子宮內(nèi)膜的ERα表達(dá), BCIP/NBT染色；b. 間情期犬子宮內(nèi)膜的ERβ表達(dá) AEC染色；c. 發(fā)情期犬子宮內(nèi)膜ERα、ERβ表達(dá)的雙染。圖3 ERα、ERβ在比格犬子宮內(nèi)的共表達(dá)Note: a. ERα expression of the endometrium of a diestrous canine uterus. BCIP/NBT staining; b. ERβ expression of the endometrium of a diestrous canine uterus. AEC staining; c. ERβ expression of the endometrium of an estrous canine uterus. BCIP/NBT & AEC double staining.Fig.3 Co-immunoexpression of ERα and ERβ in the canines uterus

3 討論

雌激素受體作為核受體超家族成員，以激素依賴的形式在生殖系統(tǒng)、骨骼、心血管系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮多種生理功能［［9，10］。為探討雌激素受體在比格犬生殖調(diào)控中的作用機(jī)理，本研究就ERα、ERβ在子宮及卵巢中的表達(dá)進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果表明不論動(dòng)物處于何種生殖生理階段，ERα主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞、卵巢間質(zhì)腺腺上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)，在卵泡膜內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞及小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞、小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞核內(nèi)也有少量表達(dá)，而ERβ則以相同的組織特異性表達(dá)于上述組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。ERα表達(dá)于膜黃體細(xì)胞的胞核內(nèi)，而在黃體顆粒細(xì)胞卻胞核與胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。而ERβ則仍特異表達(dá)于不同生理階段黃體細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，但兩種雌激素受體在黃體不同生理狀態(tài)時(shí)的表達(dá)量似存在差異。在子宮內(nèi)ERα主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體腺上皮細(xì)胞胞核內(nèi)，而在腺體周圍的基質(zhì)細(xì)胞胞核內(nèi)也有表達(dá)。ERβ主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，在腺體基質(zhì)中的血管上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá)。BCIP/NBT與AEC雙染未見 ERα、ERβ在子宮內(nèi)有明顯的共表達(dá)現(xiàn)象。而Louis LRP等在犬乳腺腫瘤中的研究結(jié)果表明:ERα特異性免疫染色僅發(fā)現(xiàn)于一例肉瘤癌的上皮細(xì)胞和少數(shù)肌源性上皮細(xì)胞胞核內(nèi);ERβ表達(dá)于上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)內(nèi)［11］;Takahashi等［12］在缺血再灌注的猴海馬ERβ的定位研究表明ERβ在CA1神經(jīng)元細(xì)胞免疫定位于胞核和胞質(zhì);Pasterkamp［13］研究小組則認(rèn)為:雌性大鼠視前核ER mRNA定位于胞質(zhì)，而與配體結(jié)合或未結(jié)合的ER蛋白均定位于胞核。與上述研究結(jié)果比較，本研究中ERβ主要定位于胞質(zhì)，而在胞核只見零星表達(dá)，分析其原因可能是:所研究組織的種屬差異，組織所處的生理或病理狀態(tài)的差異，ERβ處于配體結(jié)合狀態(tài)與否，以及可能的ERβ的不同剪接異構(gòu)體表達(dá)等。Cammarataa等［14］在ERβ的多種剪接異構(gòu)體在不同處理的人晶狀體上皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位的比較研究中表明 ERβ－1優(yōu)勢(shì)定位于線粒體，而 ERβ－2分布于所研究細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)與核內(nèi)，認(rèn)為兩種剪接異構(gòu)體不同的亞細(xì)胞定位可能是雌激素信號(hào)系統(tǒng)的一種新的調(diào)控和功能。

研究中發(fā)現(xiàn)處于不同生理狀態(tài)下的黃體 期ERα、ERβ的表達(dá)有其特殊性，ERα在間情期僅表達(dá)于黃體細(xì)胞的胞核，而發(fā)情期時(shí)則胞核胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá);ERβ則表達(dá)于不同黃體期的黃體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，但表達(dá)量在間情期與發(fā)情期似有所增加。黃體細(xì)胞分為兩種即膜黃體細(xì)胞(假黃體細(xì)胞)和黃體顆粒細(xì)胞(真黃體細(xì)胞)，電鏡下，兩種黃體細(xì)胞具有分泌類固醇激素腺細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和管狀嵴的線粒體，發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體和含膽固醇的脂類小泡，無(wú)分泌顆粒。顆粒黃體細(xì)胞主要分泌孕激素和松馳素(妊娠黃體分泌)，膜黃體細(xì)胞與顆粒黃體細(xì)胞協(xié)同作用分泌雌激素［15，16］。黃體的分泌狀態(tài)對(duì)比格犬的生殖狀態(tài)的維持具有舉足輕重的作用，因犬不同于其他哺乳動(dòng)物生殖生理的一個(gè)特點(diǎn)，就是犬維持有較長(zhǎng)的黃體期，甚至長(zhǎng)于其妊娠期，因此調(diào)控犬黃體的激素分泌狀態(tài)可能是犬生殖調(diào)控的一個(gè)重要切入點(diǎn)，因此有必要對(duì)不同生理狀態(tài)下比格犬黃體 ERα、ERβ及孕激素受體(progesteron receptor，PR)的表達(dá)情況作進(jìn)一步的研究。

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