朱皓，呂丹，高凱，張連峰，2

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是導(dǎo)致心力衰竭的主要病因之一，是一種以單側(cè)或雙側(cè)心腔擴(kuò)大和心肌收縮功能受損為主要特征的心肌疾?。?－3］，臨床表現(xiàn)為心室收縮功能減低、伴或不伴有充血性心力衰竭和心律失常，可發(fā)生栓塞和猝死等并發(fā)癥。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高場(chǎng)強(qiáng)磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)影像學(xué)技術(shù)在評(píng)價(jià)心肌病變方面已經(jīng)得到比較廣泛應(yīng)用。臨床研究表明應(yīng)用心臟電影(CINE)MRI可以看到擴(kuò)張型心肌病患者的左心室容量明顯增大，各室壁運(yùn)動(dòng)呈彌漫性減弱，而射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率及室壁增厚率明顯變小［3］。同時(shí)，隨著臨床 MRI技術(shù)的發(fā)展，心臟 MRI已成為無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)右心室結(jié)構(gòu)及功能的理想方法［4，5］。

cTnTR141W小鼠是由本實(shí)驗(yàn)室建立的一種擴(kuò)張型心肌病轉(zhuǎn)基因模型小鼠［6］。在以往的研究中，利用超聲分析研究活體 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠模型左心室結(jié)構(gòu)和功能改變，發(fā)現(xiàn)該模型小鼠的左心室擴(kuò)大，室壁變薄，心肌收縮力下降，成為擴(kuò)張性心肌病研究的小鼠模型之一。但是，已有的研究主要集中在左心室的結(jié)構(gòu)與功能方面。本文的目的是利用高場(chǎng)強(qiáng)MRI對(duì)活體擴(kuò)心病轉(zhuǎn)基因小鼠模型左、右心室進(jìn)行對(duì)比研究，確定cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠右心室的病理生理改變，確定該小鼠作為右心室心肌病的動(dòng)物模型可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用2、4、6和8月齡雌性cTnTR141W擴(kuò)心病轉(zhuǎn)基因小鼠模型及同齡轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠(non－transgenic mice，NTG)各 3只作為研究對(duì)象。模型前動(dòng)物由北京維通利華股份有限公司提供【SCXK(京)2009－0007】。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(京)2010－0029】。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為 ILAS－GC－2012－001。

1.2 MRI圖像掃描

掃描前采用1.5%～2%異氟烷和氧氣混合氣體對(duì)小鼠進(jìn)行吸入麻醉(Visualsonics，Canada)。當(dāng)小鼠完全麻醉后，將小鼠俯臥位固定于掃描床上的小鼠心臟陣列線圈上，并且使小鼠胸部對(duì)準(zhǔn)線圈中心。利用生理參數(shù)監(jiān)護(hù)系統(tǒng)(SA Instruments，Belgium)實(shí)時(shí)監(jiān)控小鼠的呼吸和心電(ECG)，并且利用呼吸、ECG門控觸發(fā)采集信號(hào)。同時(shí)利用熱風(fēng)使動(dòng)物體溫保持(37±1)℃。

利用Varian 7.0 T/160 mm磁共振儀(Varian，Palo Alto，CA，USA)，首先進(jìn)行梯度回波序列(gradient echo，GRE)掃描小鼠胸腔標(biāo)準(zhǔn)橫軸位，然后進(jìn)行心臟電影掃描。心臟電影(CINE)掃描采用ECG和呼吸門控激發(fā)。①在標(biāo)準(zhǔn)的橫軸位圖像上，定位線通過(guò)左室心尖和二尖瓣中點(diǎn)，即可獲得左室兩腔心切面;②在左室兩腔心切面上，定位像通過(guò)左室心尖和二尖瓣口中點(diǎn)，即可獲得四腔心切面;③在左室兩腔心或四腔心切面上，定位線從心底至心尖垂直于左室長(zhǎng)軸均可獲得一系列左室短軸切面圖像。范圍覆蓋心底至心尖，于呼氣末屏氣進(jìn)行掃描，獲得7～8層心室短軸位電影圖像。整個(gè)采集過(guò)程由心電和呼吸門控觸發(fā)。CINE掃描參數(shù):TE:2.3 ms，TR:157 ms，翻轉(zhuǎn)角(flip angle):20°，層厚(thickness):1 mm，層間距(Gap):0 mm，視野(FOV):25 mm ×25 mm，激勵(lì)次數(shù)(NEX):2，矩陣(matrix):256×256。每一心動(dòng)周期采集12幀電影圖像。由此得到各月齡轉(zhuǎn)基因模型小鼠與對(duì)照組左心室(left ventricle，LV)和右心室(right ventricle，RV)短軸圖像(圖 1)。

1.3 參數(shù)測(cè)量及統(tǒng)計(jì)

采用MRI自帶軟件Vnmr J 3.1軟件對(duì)心臟電影圖像進(jìn)行測(cè)量和計(jì)算。在心室短軸層面選擇每一層面的舒張末和收縮末時(shí)相的圖像各一幀(圖1，彩插4)，用鼠標(biāo)手工分別繪制出左、右心室內(nèi)膜的輪廓曲線，乳頭肌層面將乳頭肌畫入血池內(nèi)，不包括左室流出道層面。用公式［7］

計(jì)算左、右心室舒張末期容積(end－diastolic volume，EDV)和收縮末期容積(end－systolic volume，ESV)，并計(jì)算射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)量3次，取3次測(cè)量的平均值。

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各個(gè)參數(shù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)。用P＜0.05表示差異的顯著性。

1.4 病理分析

選用6月齡對(duì)照組及 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠后，打開(kāi)胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林中24 h，脫水，石蠟包埋及切片，H＆E或 Masson染色后顯微鏡下觀察(Nikon顯微鏡，日本)組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心室的磁共振圖像分析

利用MRI心臟電影序列(CINE)對(duì)同窩陰性小鼠3只和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠3只進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，磁共振圖像見(jiàn)圖2。與同窩陰性小鼠相比，cT－nTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠在2月齡出現(xiàn)雙側(cè)心室腔擴(kuò)張的趨勢(shì)，8月齡時(shí)，雙側(cè)心室腔明顯擴(kuò)張，動(dòng)態(tài)電影圖像顯示雙側(cè)室壁運(yùn)動(dòng)度明顯降低。

2.2 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的左心室功能分析

通過(guò)心臟 MRI圖像，分別對(duì)2、4、6和8月齡的NTG和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠進(jìn)行左心室形態(tài)及功能分析。結(jié)果如圖3所示，2月齡時(shí)，cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠左心室EDV和ESV均大于對(duì)照組，而EF值小于對(duì)照組，但無(wú)明顯差異;但4、6和8月齡這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)cTnTR141W模型小鼠左心室EDV和ESV均大于對(duì)照組，而EF值小于對(duì)照組，并且差異有顯著性(P＜0.05)，這與我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)到的超聲心動(dòng)圖的分析結(jié)果是一致的［6］。

分別在 2、4、6和 8月齡四個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè) cT－nTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠左心室形態(tài)和功能的變化情況。結(jié)果顯示，與同窩陰性小鼠比較，4、6和8月齡cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠左心室舒張末容積(LV EDV)分別增加了38.56%、56.67%和54.54%;收縮末容積(LV ESV)分別增加了102.5%、137.2%和 168.3%;射血分?jǐn)?shù)(LV EF)降低了 34.22%、39.07和45.18%。

與2月齡同組小鼠比較，8月齡的 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠左心室舒張末容積(LV EDV)增加59.66%，收縮末容積(LV ESV)增加了約1倍，射血分?jǐn)?shù)(LV EF)降低28.05%，而對(duì)照組小鼠無(wú)明顯變化(如圖3)。以上結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，cT－nTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠左心室擴(kuò)張和心室功能下降越來(lái)越顯著。

注:用CINE序列計(jì)算不同月齡(2、4、6、8月齡)的轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠(NTG)和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠的(A)左室舒張末容積(LV EDV);(B)左室收縮末容積(LV ESV);(C)左室射血分?jǐn)?shù)(LV EF)。圖3 小鼠左心室功能參數(shù)測(cè)定Note:Left ventricular functional parameters of the mice at 2，4，6 and 8 months of age:(A)Left ventricular end－diastolic volume;(B)Left ventricular end－systolic volume;(C)Left ventricular ejection fraction.Fig.3 Left ventricular functional parameters of the mice

2.3 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的右心室功能分析

分別對(duì)2、4、6和 8月齡的 NTG和 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠心臟MRI電影(CINE)圖像進(jìn)行右心室形態(tài)及功能分析。結(jié)果如圖4所示，在2月齡時(shí)，cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠右心室的EF值已明顯小于對(duì)照組(P＜0.05)，4、6和8月齡cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠右心室 EDV和ESV均大于對(duì)照組，并且有顯著性差異(P＜0.05)。這種差異一直持續(xù)到8月齡。

分別在 2、4、6和 8月齡四個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè) cT－nTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠右心室形態(tài)和功能的變化情況。結(jié)果顯示，與同窩陰性小鼠比較，4、6和8月齡cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠右心室舒張末容積(RV EDV)分別增加了16.8%、18.14和48.14%;收縮末容積(RV ESV)分別增加了60.66%、87.64和157.3%;射血分?jǐn)?shù)(RV EF)分別降低了27.67%、47.61%和64.59%。

與2月齡同組小鼠比較，8月齡的 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠右心室舒張末容積(RV EDV)增加70.52%，收縮期容積(RV ESV)增加了約1.5倍，射血分?jǐn)?shù)(RV EF)降低57.22%，而對(duì)照組小鼠無(wú)明顯變化(圖4)。以上結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠右心室擴(kuò)張和心室功能下降越來(lái)越顯著。

2.4 cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠模型右心室病理分析

將6月齡NTG和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠心臟進(jìn)行病理解剖，發(fā)現(xiàn)cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟整體明顯大于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，H＆E染色發(fā)現(xiàn)cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠左、右心室明顯增大(圖5AB)，高倍鏡下可見(jiàn)cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞不均勻肥大，且排列不齊，心肌纖維局部出現(xiàn)斷裂(圖5C－D);Masson染色可見(jiàn)，cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠心肌膠原沉積明顯增多，纖維化程度明顯增強(qiáng)(圖5EF)。圖5見(jiàn)彩插4。

注:用CINE序列計(jì)算不同月齡(2、4、6、8月齡)的轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠(NTG)和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠的(A)右心室舒張末容積(RV EDV);(B)右心室收縮末容積(RV ESV);(C)右心室射血分?jǐn)?shù)(RV EF)。圖4 小鼠右心室心功能參數(shù)測(cè)定Note:Right ventricular functional parameters of the mice at 2，4，6 and 8 months of age:(A)Right ventricular enddiastolic volume;(B)Right ventricular end－systolic volume;(C)Right ventricular ejection fraction.Fig.4 Right ventricular functional parameters of the mice

注：對(duì)6月齡轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠進(jìn)行組織學(xué)觀察：（A）轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠心臟短軸整體切片，H&E染色；（B）cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠心臟短軸整體切片，H&E染色；（C）轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠右室心肌，H&E染色高倍截圖；（D）cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠右室心肌，H&E染色高倍截圖；（E）轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠右室心肌，Masson染色；（F）cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠右室心肌，Masson染色。圖5 小鼠右心室組織學(xué)改變Note: Histology analysis of NTG and the cTnTR141W transgenic model mice at 6 months of age. The section of cardiac short axis from a NTG mouse, HE staining (A) and a cTnTR141W transgenic model mouse (B). Sections of the right ventricular myocardium from a NTG mouse (C) and a cTnTR141W transgenic model mouse (D), HE staining. Sections of the right ventricular myocardium from a NTG mouse (E), and a cTnTR141W transgenic model mouse (F). Masson staining.Fig.5 Pathological changes in the myocardium of right ventricle in the mice

3 討論

在臨床研究中，擴(kuò)張型心肌病的超聲心動(dòng)圖主要診斷依據(jù)是心腔大、室壁薄、瓣口小、運(yùn)動(dòng)弱。由于右心室結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及胸腔所處位置的影響，使得常規(guī)的超聲技術(shù)評(píng)估右心室功能相對(duì)困難。我們以往對(duì)心肌組織特異表達(dá)cTnTR141W基因的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能的分析主要利用超聲技術(shù)作為手段［5］，主要集中于左心室的研究。發(fā)現(xiàn)該模型小鼠的左心室擴(kuò)大，室壁變薄，心肌收縮力下降。但對(duì)于右心室結(jié)構(gòu)和功能尚未進(jìn)行研究。

臨床診斷證明MRI檢測(cè)DCM左心室的心功能變化與超聲心動(dòng)圖結(jié)果有良好的一致性，而且受右心室形態(tài)不規(guī)則的影響較小，準(zhǔn)確性高，可重復(fù)性強(qiáng)［4，5，9］。磁共振(MRI)心臟電影序列(CINE)可獲得整個(gè)心動(dòng)周期內(nèi)心臟運(yùn)動(dòng)的連續(xù)影像，可更清楚地顯示出心肌于舒張期和收縮期不同時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化情況。心室短軸位電影圖像，空間分辨率高，心內(nèi)膜邊界清晰，可以準(zhǔn)確劃分血池和心肌的界限，通過(guò)軟件后處理得到心室整體功能的定量參數(shù)，如心室容量、射血分?jǐn)?shù)等，能全面地反映心臟功能的情況，是臨床評(píng)價(jià)心功能的可靠方法。正是由于以上優(yōu)點(diǎn)，心臟cine－MRI己成為評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

本文的目的是利用高場(chǎng)強(qiáng)MRI對(duì)活體擴(kuò)心病轉(zhuǎn)基因小鼠模型左、右心室進(jìn)行對(duì)比研究。通過(guò)2、4、6和8月齡轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照小鼠和cTnTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠的 MRI心臟電影圖像分析得出，在 cT－nTR141W轉(zhuǎn)基因模型小鼠左心室與右心室的結(jié)構(gòu)和功能變化的病理進(jìn)程幾乎同步，并且隨著月齡增大，心室擴(kuò)張、心室功能下降的情況越來(lái)越顯著。對(duì)6月齡cTnTR141W轉(zhuǎn)基因小鼠右心室進(jìn)行病理組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)右心室心肌細(xì)胞不均勻肥大、心肌間質(zhì)纖維化程度顯著增強(qiáng)。

除右室性心肌病外，多種原因會(huì)導(dǎo)致右心室功能下降，如肺動(dòng)脈高壓可使右心室負(fù)荷增大，心室擴(kuò)張，冠狀動(dòng)脈血液灌注減少，心內(nèi)膜下心肌和乳頭肌缺氧、缺血狀態(tài)加重，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害，出現(xiàn)右心室收縮功能減低，甚至出現(xiàn)慢性肺源性心臟病(簡(jiǎn)稱肺心病)等疾?。?0，11］。反過(guò)來(lái)，右心室功能下降也會(huì)影響肺循環(huán)，導(dǎo)致機(jī)體缺氧、缺血狀態(tài)和多種繼發(fā)性疾病［12］。本文利用 MRI心臟電影序列(CINE)，建立了小鼠右心室分析方法，并證實(shí)該小鼠具有明顯和典型的右心室擴(kuò)張表型，不僅可作為擴(kuò)張性心肌病模型，同時(shí)也可作為右室性心肌病等右心室功能下降相關(guān)疾病研究的疾病動(dòng)物模型。

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