魏東，劉英，賈寧，徐彤，劉貴河

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070;2.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性加重的呼吸困難、難治性低氧血癥和肺水腫，嚴(yán)重時(shí)稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。致病因素包括嚴(yán)重感染敗血癥、創(chuàng)傷、中毒、大量輸血、體外循環(huán)和彌漫性血管內(nèi)凝血等，其中以嚴(yán)重感染最為常見［1］。ALI是流感病毒感染哺乳動(dòng)物的主要癥狀之一，但其確切發(fā)病機(jī)理并不很清楚，近年來對(duì)其機(jī)理的研究主要集中在細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的作用上。我們選擇H9N2豬流感病毒(H9N2－SIV)誘導(dǎo)小鼠 ALI過程的不同時(shí)期，檢測(cè)致炎細(xì)胞因子白介素－1β (interleukin－1β，IL－1β)、白介素－6(interleukin－6，IL－6)［2］以及抗炎細(xì)胞因子白介素－10(interleukin－10，IL－10)的含量，從細(xì)胞因子水平分析探討這些炎癥因子在H9N2亞型豬流感病毒誘導(dǎo)小鼠ALI發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

豬流感病毒A/swine/HeBei/012/2008(H9N2)由本課題組分離，河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;采用雞胚尿囊腔接種法擴(kuò)增病毒，每只胚接種0.1 mL，孵化72 h，收獲供研究用病毒。

6～8周齡 SPF級(jí) BALB/c雌性小鼠80只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司［SCXK(京)2009－0004］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國人民解放軍251醫(yī)院三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行［SYXK(軍)2007－018］，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

小鼠 TNF－α ELISA 試劑盒、小鼠 IL－1β ELISA試劑盒、小鼠IL－6 ELISA試劑盒和小鼠IL－10 ELISA試劑盒，博士德生物工程有限公司。

其他實(shí)驗(yàn)藥品均為分析純，試劑由課題組自配。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與感染

進(jìn)鼠前，將鼠籠用紫外線照射12 h消毒，同時(shí)對(duì)動(dòng)物室進(jìn)行全面消毒，飼料、飲水高壓消毒。所有小鼠均在已消毒的動(dòng)物室中隔離飼養(yǎng)，采取自由飲水和采食，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

80只小鼠隨機(jī)平均分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用滅菌生理鹽水5倍稀釋的含有H9N2亞型豬流感病毒(H9N2－SIV)的雞胚尿囊液經(jīng)鼻腔接種小鼠，接種劑量為每只0.1 mL(約含1×103MLD50)。對(duì)照組小鼠采取相同途經(jīng)接種0.1 mL的經(jīng)滅菌生理鹽水5倍稀釋的正常雞胚尿囊液。具體造模方式參照文獻(xiàn)［3］。

1.2.2 標(biāo)本的采集

接種開始前的時(shí)刻記為 0 d，分別在 2、4、6、10、14 d兩組各隨機(jī)抽取5只小鼠，實(shí)施安樂死，迅速剝離肺組織，立即用無菌冷生理鹽水漂洗去表面血污，濾紙吸干，稱重后放在勻漿器口部，用眼科剪剪成碎塊，加入9倍重的冷生理鹽水將剪碎肺組織沖入勻漿器中，在冰浴中充分研磨勻漿。將肺組織勻漿液3000 r/min 4℃離心15 min，取上清液，置 －80℃凍存待測(cè)。

1.2.3 標(biāo)本的檢測(cè)

酶聯(lián)免疫法(雙抗體夾心ELISA法)操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。終止反應(yīng)后，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀槽內(nèi)，選擇450 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果，單位為ng/mL。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

將所有檢測(cè)樣本(測(cè)定值為光密度)換算成濃度單位，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以()表示，SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)(independent sample t test)，P＜0.05判為差異有顯著性，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)肺組織勻漿中TNF－α、IL－1β、IL－6 和 IL－10 濃度均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)(圖1)，兩組肺組織勻漿中 TNF－α、IL－1β、IL－6 和 IL－10 的濃度變化見表 1。TNF－α 和IL－1β在損傷后第2天急劇升高，第4天達(dá)到高峰后開始下降，至14 d后趨于正常;IL－6及IL－10于損傷后第2天開始升高，至第6天達(dá)到高峰，第10天雖然有所下降，但下降幅度不大，到14 d仍高于正常對(duì)照組。

圖1 肺組織勻漿中炎癥因子濃度均值的比較Fig.1 Comparison of the mean concentrations of inflammatory factors in the lung tissue homogenates

表1 肺組織勻漿中炎癥因子濃度的變化(，n=5，ng/mL)Tab.1 Changes of the concentrations of inflammatory factors in the lung tissue homogenates(，n=5，ng/mL)

表1 肺組織勻漿中炎癥因子濃度的變化(，n=5，ng/mL)Tab.1 Changes of the concentrations of inflammatory factors in the lung tissue homogenates(，n=5，ng/mL)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0.05，ΔP ＜0.01。Note:Compared with the control group，*P ＜0.05，ΔP ＜0.01

炎癥因子濃度的變化Changes of concentration of inflammatory factors TNF－α IL－1β IL－6 IL－10對(duì)照組 control group 25.76±6.52 28.28±5.28 19.35±8.17 80.57±12.25組別Groups實(shí)驗(yàn)組Infected group 2 d 40.31±8.31* 42.81±8.63* 23.26±10.23* 103.73±18.52Δ 4 d 44.70±13.62Δ 44.21±12.14Δ 24.81±10.72Δ 141.73±20.15Δ 6 d 41.81±9.17Δ 43.59±11.92Δ 32.35±12.57Δ 145.73±15.71*10 d 33.48±5.15* 34.96±6.21* 31.04±8.64Δ 123.07±11.32*14 d 31.59±6.07* 31.53±4.11* 25.81±7.87* 103.40±11.87Δ

3 討論

既往研究表明:流感病毒感染可波及肺間質(zhì)和肺泡而引起肺炎，細(xì)胞因子在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［4］。病毒感染后通過細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，激活內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞，繼而調(diào)節(jié)黏附分子的合成及其在細(xì)胞表面的表達(dá)［5］。

TNF－α是介導(dǎo)ALI的主要細(xì)胞因子。TNF－α能夠誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞脫顆粒和毛細(xì)血管滲漏，積聚的水腫液進(jìn)一步阻礙了肺泡細(xì)胞的灌流和氧氣交換，引起 ARDS。此外，TNF－α還可與多種細(xì)胞因子相互聯(lián)系，產(chǎn)生廣泛作用，如TNF－α與IL－1產(chǎn)生協(xié)同作用，激活肺部炎性細(xì)胞的核因子 κB，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(如 IL－6、IL－8、干擾素 γ、粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 等)，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［6］。IL－1β 可以刺激多種趨化因子的產(chǎn)生，如IL－8、上皮細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞趨化物、單核細(xì)胞趨化肽以及巨噬細(xì)胞炎性趨化肽1α等，所以它在 ALI/ARDS時(shí)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中占有主導(dǎo)位置［7］。盡管有研究指出，在ALI/ARDS中IL－1β還參與了損傷的肺泡上皮的修復(fù)［8］;但長(zhǎng)期大量實(shí)驗(yàn)研究顯示其仍以促炎作用為主，修復(fù)作用還有待進(jìn)一步研究。IL－6是機(jī)體創(chuàng)傷和修復(fù)過程中一種重要的急性期反應(yīng)介質(zhì)，在創(chuàng)傷和炎癥過程中，具有雙重作用，既有致炎作用又有抗炎作用［9］。有報(bào)道稱其在不同情況下可發(fā)揮炎癥因子或抗炎因子的作用，但在急性肺損傷中IL－6是炎癥因子還是抗炎因子尚未明確［10］。IL－10是機(jī)體重要的一個(gè)抗炎因子，抑制某些促炎因子(IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－8 等)的產(chǎn)生，防止機(jī)體發(fā)生繼發(fā)性的組織損傷［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在H9N2亞型豬流感病毒誘導(dǎo)小鼠ALI發(fā)生、發(fā)展過程中，炎癥因子相互誘導(dǎo)、相互協(xié)同，發(fā)揮著極其重要的作用:TNF－α、IL－1β 起致炎因子的作用，含量迅速增加，引起局部炎性反應(yīng)和器官的損害;IL－6在各時(shí)間點(diǎn)均明顯增加，隨著ALI時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量有逐漸增加趨勢(shì)，與抗炎因子IL－10有相同趨勢(shì)，說明 IL－6在本實(shí)驗(yàn)中可能發(fā)揮抗炎的作用，這還有待于進(jìn)一步的研究。IL－10起抗炎因子的作用，與 TNF－α、IL－1β 比較，其含量增加較緩，但持續(xù)增加時(shí)間長(zhǎng)，而且下降時(shí)間較晚，說明 IL－10 是在 TNF－α、IL－1β 發(fā)揮作用后，才誘導(dǎo)其大量釋放，同時(shí)也說明 IL－10在 ALI的轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。

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