孫玉竹，劉迪文，吳舊生

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310058)

目前在分子生物學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)等實(shí)驗(yàn)中，普遍采用各類細(xì)胞株作為試驗(yàn)載體，但由于細(xì)胞株部分基因已經(jīng)變異或者缺失，因此變得和機(jī)體正常細(xì)胞的性狀存在很大差異，而原代細(xì)胞比細(xì)胞株能更接近地反映機(jī)體正常細(xì)胞的生理狀態(tài)。如果能克服原代細(xì)胞培養(yǎng)難度較大，純化和傳代較為困難的缺點(diǎn)，其應(yīng)用前景將大為增加。相對(duì)其他嚙齒類動(dòng)物，豚鼠的生物學(xué)及遺傳特性更接近于人類，是一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。豚鼠腎小管上皮細(xì)胞是培養(yǎng)病毒、研發(fā)相關(guān)疫苗及免疫學(xué)和腎病研究等較理想的材料，然而目前有關(guān)豚鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的完整資料鮮有報(bào)道。因此本文探討了有關(guān)豚鼠腎小管上皮原代細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，并成功建立了培養(yǎng)腎小管上皮原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生一周以內(nèi)的 Zmu－1:DHP品系豚鼠一只，3日齡，雄性，普通級(jí)，來自于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(浙)2007－0030】，實(shí)驗(yàn)在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK(浙)2007－0099】。

1.2 主要試劑、器材及儀器

DMEM:F12(含1%雙抗)細(xì)胞培養(yǎng)液，0.25%胰酶(Gibco)，0.1%膠原酶，多聚賴氨酸(10×)，胎牛血清(四季青)，小鼠抗CK18抗體及同型小鼠血清(博士德)，兔抗小鼠 FITC二抗(碧云天)，滅菌PBS液;細(xì)胞培養(yǎng)板(12孔)，篩網(wǎng)(100目和 150目)，研磨器;離心機(jī)(Eppendorf)，生物安全柜(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(Leica)，普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)等。

1.3 腎小管節(jié)段的提取

豚鼠腹腔麻醉后股動(dòng)脈放血處死，然后浸入酒精體外消毒，轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。無菌摘取豚鼠兩側(cè)腎臟，置于滅菌平皿內(nèi)。生理鹽水洗滌2次，用鑷子剝除腎臟外的脂肪及包膜，剪刀縱向剪開腎臟，去除髓質(zhì)部，收集皮質(zhì)部。用剪刀將皮質(zhì)組織充分剪碎至1 mm3左右，放入研磨器中輕輕研磨，并加PBS沖洗。研磨至糊狀后，轉(zhuǎn)移至100目不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯在網(wǎng)上輕輕研磨，同時(shí)加 PBS沖洗，收集網(wǎng)下過濾的組織勻漿，將其再加至150目篩網(wǎng)上［1］，用注射器內(nèi)芯繼續(xù)研磨，加 PBS沖洗，收集網(wǎng)上組織物，然后再用PBS反向沖洗篩網(wǎng)，收集沖洗下來的組織物即為腎小管節(jié)段，合并置于離心管內(nèi)。

1.4 腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

將離心管內(nèi)組織物離心去除上清，加入DMEM:F12培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，充分混勻，等量分為5份，分別為A、B、C、D、E組，進(jìn)行下列不同處理及培養(yǎng)。

A組:直接選取形態(tài)較長(zhǎng)，纏繞較多的腎小管節(jié)段，放入涂有膠原蛋白的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入含5%胎牛血清的DMEM:F12培養(yǎng)液1 mL，置于 CO2孵箱，經(jīng) 5%CO2、37℃ 培養(yǎng)。

B組:在細(xì)胞液中加入0.25%胰酶進(jìn)行37℃消化，時(shí)間為8 min，鏡下觀察，腎小管節(jié)段大多消化成小節(jié)段［2］。加血清終止消化后，離心去除胰酶，用含5%胎牛血清的DMEM:F12重懸培養(yǎng)物，同A組方法培養(yǎng)。

C組:加入0.1%的I型膠原酶37℃消化，時(shí)間為8 min。鏡下觀察，經(jīng)消化的節(jié)段比胰酶消化更小，離心去除I型膠原酶，同上方法培養(yǎng)。

D組:加入 0.25%胰酶 37℃消化，時(shí)間為 20 min，收集上清液，1000 r/min離心得到細(xì)胞沉淀。在原有的節(jié)段中再加入胰酶，重復(fù)消化一次，收集上清液，離心得到細(xì)胞沉淀。將所得細(xì)胞沉淀合并，重懸混勻計(jì)數(shù)，同上方法培養(yǎng)。

E組:加入0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃消化20 min，收集上清液，剩余節(jié)段再加入膠原酶消化，重復(fù)消化2次收集的上清液，直到完全消化為止。將所得的細(xì)胞上清液經(jīng)1000 r/min離心得到細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)后同上培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

在腎小管上皮細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，用0.25%胰酶消化，然后傳代。吸凈培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基潤(rùn)洗兩次，加入100 μL胰酶，鏡下觀察，待大部分細(xì)胞收縮后，加入含血清培養(yǎng)基終止消化。吸棄胰酶，加入無血清培養(yǎng)液輕輕吹打，收集上清液至離心管內(nèi)。潤(rùn)洗培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞數(shù)次，繼續(xù)加入胰酶消化，當(dāng)鏡下觀察剩余的貼壁細(xì)胞松動(dòng)后，加入含血清培養(yǎng)液吹打數(shù)次，終止消化。收集細(xì)胞，經(jīng)1500 r/min離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，重懸計(jì)數(shù)后培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞鑒定

洗去培養(yǎng)皿中傳代細(xì)胞的培養(yǎng)液，用固定液固定20 min。洗去固定液，用封閉液封閉60 min。吸棄封閉液，每孔加入1∶1000稀釋的小鼠抗CK18抗體 100 μL，對(duì)照孔加同型小鼠血清 100 μL，4℃ 過夜。洗去一抗和同型血清后，加入兔抗小鼠FITC二抗，避光孵育1 h，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果

2.1 腎小管節(jié)段提取及其細(xì)胞生長(zhǎng)

圖1顯示，從腎臟皮質(zhì)部初步分離的腎小管清晰可見。經(jīng)過酶短暫消化后的腎小管節(jié)段變短，透明度增加，管中顆粒清晰(圖2)。經(jīng)培養(yǎng)后上皮細(xì)胞從腎小管節(jié)段的缺口部分生長(zhǎng)出來，向外蔓延(圖3)。上皮細(xì)胞從腎小管節(jié)段周圍快速增長(zhǎng)，使得腎小管節(jié)段逐漸變短，最后消失(圖4)。迅速增殖的腎小管上皮細(xì)胞，已經(jīng)平鋪于培養(yǎng)皿底部(圖5)。典型的腎小管上皮細(xì)胞呈鋪路石形狀，細(xì)胞邊緣清晰，折光性強(qiáng)，原代細(xì)胞大小均勻飽滿。成片培養(yǎng)的細(xì)胞純度較高，不含其他雜細(xì)胞。圖1～5見封底。

2.2 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的培養(yǎng)效果

A組腎小管節(jié)段大部分在24～48 h內(nèi)貼壁，且節(jié)段周圍有少量的上皮樣細(xì)胞長(zhǎng)出。將細(xì)胞換成含10%胎牛血清的DMEM:F12培養(yǎng)液，在72 h后快速增殖，至第4～7天內(nèi)細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)式增長(zhǎng)，第9天左右長(zhǎng)滿80%。

B組在48 h后觀察，腎小管節(jié)段貼壁數(shù)量明顯比A組少，且貼壁節(jié)段周圍未長(zhǎng)出上皮樣細(xì)胞，換液后，于第4天可以看見少量的細(xì)胞在節(jié)段周圍增殖，第6天左右進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，之后每24 h換一次液，第12天左右長(zhǎng)滿。

C組腎小管節(jié)段基本都在36 h左右貼壁，且能看到明顯的上皮樣細(xì)胞在節(jié)段周圍長(zhǎng)出，第3天左右細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，每隔24 h換一次液，7 d左右長(zhǎng)滿。

D組細(xì)胞于48 h左右在鏡下觀察，仍然處于漂浮狀態(tài)，基本沒有貼壁。72 h左右仍然沒有細(xì)胞貼壁增長(zhǎng)的跡象，臺(tái)盼藍(lán)染色，顯示大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)死亡。

E組細(xì)胞48 h左右觀察大多數(shù)貼壁，但仍然有部分細(xì)胞懸浮，換液后明顯增殖，第4天左右進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，第8天左右長(zhǎng)滿。

2.3 傳代細(xì)胞的培養(yǎng)

第2代腎小管傳代上皮細(xì)胞?？梢娂?xì)胞生長(zhǎng)迅速，大多數(shù)上皮樣細(xì)胞維持鋪路石形狀，但少量細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變小、折光暗淡及不規(guī)則形狀，失去凹凸感。圖6見封底。

2.4 培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定

通過以上圖片可見，小管上皮細(xì)胞從腎小管組織中向外延伸增殖;平鋪細(xì)胞呈現(xiàn)與其他動(dòng)物和人腎小管上皮細(xì)胞類似的鋪路鵝卵石形狀;另外，用CK18抗體染色鑒定腎小管上皮細(xì)胞，可見熒光染色后細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色熒光［3］(圖7見封底)。這些結(jié)果充分證明本研究分離培養(yǎng)的是腎小管上皮細(xì)胞，并且純度較高。

3 討論

雖然豚鼠腎小管上皮細(xì)胞的應(yīng)用和培養(yǎng)在多處論文和資料上提及，但都沒有完整和具體方法介紹。本實(shí)驗(yàn)通過五種方法的嘗試，得到了一種比較行之有效的腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，即C組方案。利用膠原酶短時(shí)間內(nèi)消化提取的腎小管節(jié)段，得到較小節(jié)段，然后貼壁培養(yǎng)，可以得到較為純凈的腎小管上皮細(xì)胞，且增殖較快。其次，也可以使用胰酶消化，但效果較膠原酶稍差。原因可能是胰酶對(duì)于腎小管上皮有一定的傷害作用，影響其正常的生理功能。長(zhǎng)時(shí)間胰酶消化得到的細(xì)胞懸液，基本沒有貼壁增殖的可能。腎小管上皮細(xì)胞對(duì)于胰酶較為敏感，所以在傳代的過程中，要在鏡下觀察消化的狀況，控制消化終止時(shí)間是能否成功傳代的關(guān)鍵，時(shí)間過長(zhǎng)則細(xì)胞狀態(tài)很差，難以增殖［4］。本實(shí)驗(yàn)所得到的傳代細(xì)胞折光性較強(qiáng)，形態(tài)結(jié)構(gòu)為一致的鋪路石形狀，效果較好。

本實(shí)驗(yàn)的方案通過篩網(wǎng)過濾，能得到非常純凈的腎小管節(jié)段，基本不含其他組織結(jié)構(gòu)，所以得到的腎小管上皮細(xì)胞純度很高，沒有明顯的雜細(xì)胞。在傳代過程中，利用上皮細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)的特點(diǎn)，吸棄最先脫落的細(xì)胞，這樣可以進(jìn)一步純化腎小管上皮細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)建立了比較完備的制備豚鼠腎小管上皮細(xì)胞的方法，獲得了細(xì)胞培養(yǎng)各階段的直接圖片證據(jù)，且方法簡(jiǎn)便易行，沒有復(fù)雜昂貴的操作步驟，這為進(jìn)一步研究工作提供了可行的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

圖1 分離所得的腎小管節(jié)段Fig.1 Separated tubular segments

圖2 消化后腎小管節(jié)段Fig.2 Tubular segments, after digestion

圖3 貼壁后細(xì)胞在腎小管節(jié)段周圍長(zhǎng)出Fig.3 Outgrowth of epithelial cells from tubular segments

圖4 腎小管節(jié)段周圍細(xì)胞快速增殖、節(jié)段縮小Fig.4 Rapid proliferation of cells around the diminishing tubular segment

圖5 迅速增殖的腎小管上皮細(xì)胞、節(jié)段消失Fig.5 Rapidly proliferating epithelial cells. The segment was no longer seen

圖6 傳代后的腎小管上皮細(xì)胞Fig.6 Renal tubular epithelial cells cultured after passages

圖7 加CK18后的熒光染色(A)及同型小鼠血清染色(B)Fig.7 Tubular epithelial cells after fluorescence staining for CK18 (A) and after the same type serum staining (B)

［1］吳國(guó)娟，楊明，王典仁.小鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定［J］.解剖學(xué)報(bào)，2007，38(6):765－757.

［2］王林，卓麗玲，顧建紅.SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，25(12):1445－1448.

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