曹 慧，陳小珍，朱 巖，李祖光，汪麗娜，張曉波

（1.浙江省質(zhì)量檢測科學(xué)研究院，浙江 杭州 310013；2.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310028；3.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310014）

獸藥在防治細(xì)菌等微生物感染性疾病方面起著不可替代的重要作用，主要應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)、禽類飼養(yǎng)以及漁業(yè)養(yǎng)殖?；前奉?、喹諾酮類、硝基咪唑類和青霉素類獸藥是常用的抗病菌、抗原蟲和抗寄生蟲藥物，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)上發(fā)揮著重要作用［1］。但不合理使用和濫用獸藥以及不遵守休藥期等原因致使動(dòng)物源性食品中獸藥殘留日趨嚴(yán)重，其產(chǎn)生的危害不容忽視。

目前，關(guān)于獸藥殘留的檢測方法主要有微生物法、免疫法［2］、液相色譜法［3－5］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［6－9］和飛 行時(shí)間 質(zhì)譜法［10－11］，且集中于單一種類獸藥的分析［12］，多組分獸藥殘留的報(bào)道很少。由于動(dòng)物疾病多是混合感染，在臨床治療時(shí)往往采用兩種或多種不同種類的藥物進(jìn)行聯(lián)合用藥，因此，獸藥多殘留同時(shí)檢測是近年研究的新方法［13－16］，也是未來的發(fā)展趨勢。

微生物法和免疫法具有操作簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但容易產(chǎn)生假陽性。液相色譜法具有分離速度快、分析效率高等優(yōu)點(diǎn)，由于基質(zhì)干擾的存在難于準(zhǔn)確定性和定量分析。超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）是將液相色譜的高分離效能與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及豐富的結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合的分析方法，以其操作簡便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)成為獸藥殘留檢測的篩查方法［17－22］。目前，由于獸藥在多組分化合物殘留和復(fù)雜基質(zhì)條件下進(jìn)行檢測，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的多反應(yīng)監(jiān)測模式仍受分辨率和測量精度所限，不可避免產(chǎn)生“假陽性”現(xiàn)象。飛行時(shí)間質(zhì)譜憑借其質(zhì)量測量精度高的優(yōu)點(diǎn)，已成為陽性定性確證的有效手段。

本試驗(yàn)采用同位素稀釋－固相萃?。咝б合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測定畜禽肉中磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類和青霉素類4類獸藥殘留，并對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，對篩查出的陽性樣品采用液相色譜－離子阱－飛行時(shí)間質(zhì)譜做進(jìn)一步的確證，避免“假陽性”的發(fā)生，以期定性和定量數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

AcquityTM超高效液相色譜儀和XevoTMTQ－MS質(zhì)譜儀：美國 Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧電離接口（ESI）及 Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；液相色譜－離子阱－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；Milli－Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)：美國Thermo公司產(chǎn)品；氮?dú)獯蹈蓛x：天津市恒奧科技有限公司產(chǎn)品；渦旋混合器：太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；固相萃取裝置：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純）：德國 Merck公司產(chǎn)品；甲酸（色譜純）：美國Tedia公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸二鈉鹽、磷酸氫二鈉、檸檬酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；水為Milli－Q系統(tǒng)純化水。

磺胺二甲異嘧啶鈉（純度≥99.0%），磺胺醋酰（純度≥99.5%），磺胺嘧啶（純度≥99.5%），磺胺噻唑（純度≥99.5%），磺胺吡啶（純度≥99.0%），磺胺甲基嘧啶（純度≥99.2%），甲氧芐胺嘧啶（純度≥99.5%），磺胺惡唑（純度≥98.5%），磺胺二甲嘧啶（純度≥99.0%），磺胺甲噻二唑（純度≥99.0%），磺胺對甲氧嘧啶（純度≥98.0%），磺胺甲氧噠嗪（純度≥99.2%），磺胺－6－甲氧嘧啶鈉（純度≥99.0%），磺胺氯噠嗪（純度≥99.0%），磺胺鄰二甲氧嘧啶（純度≥99.5%），磺胺甲基異惡唑（純度≥99.0%），磺胺二甲異惡唑（純度≥98.0%），苯甲酰磺胺（純度≥98.8%），磺胺間二甲氧嘧啶（純度≥99.5%），磺胺喹惡啉（純度≥98.0%），磺胺苯吡唑（純度≥99.0%），恩諾沙星（純度≥98.5%），環(huán)丙沙星鹽酸鹽（純度≥95.0%），諾氟沙星（純度≥99.0%），氧氟沙星（純度≥99.3%），氟甲喹（純度≥99.4%），惡喹酸（純度≥98.0%），雙氟沙星鹽酸鹽（純度≥99.0%），沙拉沙星鹽酸鹽（純度≥95.5%），司帕沙星（純度≥99.9%），氟羅沙星（純度≥99.0%），馬波沙星（純度≥99.8%），伊諾沙星（純度≥99.0%），奧比沙星（純度≥99.7%），吡哌酸（純度≥99.0%），培氟沙星二水甲磺酸鹽（純度≥99.0%），洛美沙星鹽酸鹽（純度≥98.0%），萘啶酸（純度≥99.5%），甲硝唑（純度≥99.5%），二甲硝基咪唑（純度≥99.0%），羥基二甲硝基咪唑（純度≥99.0%），洛硝噠唑（純度≥99.0%），異丙硝唑（純度≥99.0%），羥基異丙硝唑（純度≥99.0%），羥基甲硝唑（純度≥99.5%），青霉素G鈉鹽（純度≥99.7%），青霉素 V 鉀鹽（純度≥99.0%），氨芐西林（純度≥99.5%），哌拉西林鈉鹽（純度≥95.0%），苯唑西林（純度≥99.8%），萘夫西林鈉（純度≥86.0%），氯唑西林鈉水合物（純度≥99.0%），雙氯西林（純度≥97.0%），恩諾沙星－D5鹽酸鹽（純度≥97.0%），磺胺間二甲氧嘧啶－D6（純度≥99.5%），青霉素 G－D7鈉鹽（純度≥99.7%），羥 基 二 甲 硝 基 咪 唑－D3（純 度 ≥99.0%），二甲硝基咪唑－D3（純度≥99.0%），羥基異丙硝唑－D3（純度≥99.5%）：以上各標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10mg上述標(biāo)準(zhǔn)品（需折算標(biāo)準(zhǔn)品純度）于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1g／L儲備液，密封儲存于－18℃冰箱中。分別吸取50μL配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成5mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用時(shí)稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：方法同標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。其中磺胺類藥物、喹諾酮類藥物、青霉素類藥物、甲硝唑羥基甲硝唑和二甲硝基咪唑、羥基二甲硝基咪唑和洛硝噠唑、異丙硝唑和羥基異丙硝唑分別以磺胺間二甲氧嘧啶－D6、恩諾沙星－D5、青霉素G－D7、二甲硝基咪唑－D3、羥基二甲硝基咪唑－D3、羥基異丙硝唑－D3為內(nèi)標(biāo)化合物。

Na2EDTA－Mcllvaine溶液的配制：將1 000 mL 0.1mol／L 檸 檬 酸 溶 液 和 625mL 0.2 mol／L磷酸氫二鈉溶液混合，調(diào)節(jié)pH至4.0，配制成Mcllvaine溶液；稱取60.5g Na2EDTA于1 625mL Mcllvaine溶液中，混合均勻。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm×1.7 μm）；柱溫：35℃；樣品溫度：25℃；進(jìn)樣體積：5μL；流速：0.2mL／min；流動(dòng)相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～5min、90%B，5～9min、90%～60%B，9～13min、60%B，13～15min、60%～10%B，15～16min、10%B，16～17min，10% ～90%B、17～20min、90%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓2.80kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，脫溶劑氣流量1 000L／h。

1.4 前處理方法

1.4.1 提取 稱?。?±0.02）g勻漿試樣于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10μL內(nèi)標(biāo)混合溶液，避光放置 2min，加入 10mLV（Na2EDTAMcllvaine）∶V（乙腈）＝7∶3的混合提取液，渦旋1min，超聲提取10min，以12 000r／min離心10min后，取出上清液；再加入10mLV（Na2EDTA－Mcllvaine）∶V（乙腈）＝7∶3的混合提取液，重復(fù)上述操作，合并提取液，在40℃下氮吹減少6mL左右，待凈化。

1.4.2 凈 化 分 別 用 3mL 甲 醇、水 和Na2EDTA－Mcllvaine緩沖液活化 MCX（60mg／3mL）柱，將上述提取液上樣，用3mL水淋洗，抽至近干后，分別用3.0mL甲醇和5%氨水甲醇溶液洗脫，于45℃下氮吹至干，再加入1mLV（乙腈）∶V（水）＝1∶9的溶液溶解，渦旋混合1min，過0.22μm微孔濾膜后，UPLC－MS／MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)選用 Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×100mm×1.7μm）色譜柱分離4類獸藥，此色譜柱對各化合物具有較強(qiáng)的保留，各色譜峰峰形較好，并可以得到有效的分離，減少了雜質(zhì)的干擾。

分別選擇甲醇和乙腈作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相。試驗(yàn)證明：當(dāng)甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，離子化受到不同程度的抑制，峰形變寬，豐度明顯降低，靈敏度下降，而乙腈的離子化效率明顯優(yōu)于甲醇，故采用乙腈作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相。在流動(dòng)相中加入甲酸能增加各種化合物在ESI＋模式下的離子化效率，改善各化合物的峰形。本試驗(yàn)分別配制0.05%、0.1%和0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，0.1%甲酸水溶液體系能提供最佳的離子化條件，峰面積信號最強(qiáng)，靈敏度最高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧質(zhì)譜、正離子監(jiān)測模式下，分別對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等進(jìn)行了充分的優(yōu)化，選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高的2個(gè)子離子作為定量和定性離子，并確定其最佳碰撞能量的電壓值。所選擇的母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)列于表1。

表1 四類獸藥的質(zhì)譜分析條件Table 1 The conditions of ESI－MS／MS analysis four species of drugs

續(xù)表

2.3 萃取溶劑的選擇

由于4類藥物的酸堿性各異，pKa值范圍較寬，多易溶于乙腈、甲醇等極性溶劑，試驗(yàn)分別比較了甲醇、乙腈、Na2EDTA－Mcllvaine－乙腈和Na2EDTA－Mcllvaine－甲醇復(fù)合提取液的提取效果。由于乙腈具有較強(qiáng)的去除蛋白質(zhì)的能力，且對于多數(shù)藥物具有較好的提取效率，因此，乙腈的萃取效果優(yōu)于甲醇。在乙腈中加入Na2EDTA－Mcllvaine溶液，可以提高部分偏酸性化合物和水溶性化合物的提取效率，當(dāng)V（Na2EDTA－Mcllvaine）∶V（乙腈）＝7∶3時(shí)，各類藥物具有較好的提取效率，因此，采用V（Na2EDTA－Mcllvaine）∶V（乙腈）＝7∶3混合提取液作為本試驗(yàn)的提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

凈化效果對基質(zhì)效應(yīng)具有較大的影響，為了獲得較好的凈化效果，本試驗(yàn)選用Waters公司的 MAX、MCX、WAX、WCX和 HLB 5種類型固相萃取小柱分別考察凈化效果和保留行為，由于MCX固相萃取柱的pKa適用范圍為2～10，藥物的pKa值范圍較寬，本試驗(yàn)采用酸性提取液萃取，促使藥物電離，使其吸附到固相萃取柱上，加大化合物的保留，因此，MCX固相萃取小柱對各種藥物具有較好的吸附作用，凈化效果較好。本試驗(yàn)比較了1%、3%和5%不同濃度氨水－甲醇溶液的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇和5%氨水－甲醇依次洗脫方式可將固相萃取柱上的藥物全部洗脫。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限 配制濃度分別為5、10、50、100、200μg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各分析物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)列于表2。結(jié)果表明：各種藥物在濃度為5～200μg／L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均在0.99以上。以3倍信噪比（S／N＝3）計(jì)算方法的最低檢出限，以10倍信噪比（S／N＝10）計(jì)算方法的最低定量限，其結(jié)果列于表2。

2.5.2 精密度 在陰性豬肉樣品中添加10、50、100μg／kg 3種不同濃度水平的獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法進(jìn)行預(yù)處理，平行操作3次，結(jié)果列于表2。各種藥物在3種不同濃度下的精密度（RSD）分別為1.03%～8.04%、2.56%～9.94%、1.66%～10.94%。按日內(nèi)精密度的預(yù)處理方法，每天取樣1份，連續(xù)5天，各種藥物的 RSD 分別為 1.08% ～9.86%、2.86% ～10.04%、2.96%～11.04%，重現(xiàn)性較好。

表2 四類獸藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和精密度Table 2 Linear equations，correlation coefficients，LOD，LOQ and RSD of four species of drugs

續(xù)表

2.5.3 回收率 分別在陰性豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉樣品中添加10、50、100μg／kg 3種不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，按1.4方法進(jìn)行預(yù)處理，回收率列于表3。結(jié)果表明：各種藥物的回收率在70.0%～130.9%之間，符合獸藥多殘留分析的要求。

表3 四類獸藥的回收率Table 3 The recoveries of four species of drugs

續(xù)表

2.6 實(shí)際樣品測定與陽性定性確證

在本試驗(yàn)條件下，對日常檢測的30例畜禽肉進(jìn)行4類獸藥篩查，發(fā)現(xiàn)3例陽性樣品，其中2例豬肉樣品含有磺胺二甲嘧啶，其檢測結(jié)果分別為79.3μg／kg和250.2μg／kg，1例豬肉樣品含有磺胺鄰二甲氧嘧啶，其檢測結(jié)果為97.3 μg／kg。陽性豬肉樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖示于圖1。陽性樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和相對豐度比相吻合。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 20759—2006的前處理方法，對這3例陽性豬肉樣品進(jìn)行檢測，磺胺二甲嘧啶為80.0μg／kg和250.1 μg／kg，磺 胺 鄰 二 甲 氧 嘧 啶 為 96.2 μg／kg。結(jié)果表明：兩種方法的檢測結(jié)果較吻合，說明本方法的前處理技術(shù)適用于畜禽肉中4類獸藥殘留的篩選和檢測。

由于多反應(yīng)監(jiān)測模式存在一定的限制，為了避免三重四極桿質(zhì)譜假陽性的產(chǎn)生，本試驗(yàn)采用液相色譜－離子阱－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分別對3例陽性樣品進(jìn)行多級質(zhì)譜分析，從而做進(jìn)一步確證?；前范奏奏ず突前粪彾籽踵奏煞N化合物在離子阱－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜上的質(zhì)譜碎片與三重四極桿質(zhì)譜中的母離子和子離子完全吻合，磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品和磺胺鄰二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的三級質(zhì)譜圖分別與陽性樣品的三級質(zhì)譜圖相吻合，質(zhì)量數(shù)偏差在誤差范圍內(nèi)，說明三重四極桿質(zhì)譜在一定程度上消除了基質(zhì)干擾，其多級質(zhì)譜圖示于圖2。通過離子阱－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)定性，對樣品做進(jìn)一步的確證，可以避免假陽性的產(chǎn)生，保證結(jié)果的可靠性。

圖1 陽性豬肉樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of positive pork sample

圖2 磺胺標(biāo)準(zhǔn)品和陽性豬肉樣品的多級質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of standard and positive sample

3 結(jié)論

本工作建立了同位素稀釋－固相萃?。?lián)質(zhì)譜技術(shù)快速檢測和確證畜禽肉中4類獸藥多殘留檢測的分析方法。該方法具有靈敏度高、前處理方法簡單、回收率高且穩(wěn)定、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于畜禽肉中多類獸藥殘留的快速檢測和確證?；|(zhì)效應(yīng)在獸藥殘留分析中普遍存在，由于本試驗(yàn)在前處理方法中加入了同位素內(nèi)標(biāo)，能有效地去除基質(zhì)干擾，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，定量結(jié)果的準(zhǔn)確性更高、分析速度更快。此外，本試驗(yàn)采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和離子阱－飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合的定性分析方法，可以有效地消除由儀器檢測所產(chǎn)生假陽性，保證了定性和定量結(jié)果的可靠性。該方法適用于畜禽肉中多類獸藥殘留的快速檢測和確證。

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