陳慧華，韋敏玨，周 煒，朱聰英，應(yīng)永飛

（浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，浙江 杭州 310020）

金剛烷胺（amantadine，AMT）屬于三環(huán)胺類，又稱金剛胺、三環(huán)癸胺等，合成于1960年，首先作為抗病毒藥使用，主要用于預(yù)防亞洲甲型流感病毒的感染，對該型流感接觸者保護率為70%，已感染者如能及時用藥可減輕癥狀，且退熱作用明顯［1－2］。金剛乙胺（rimantadine，RMT）是金剛烷胺類似物，作為抗病毒藥對A型流感病毒有預(yù)防和治療作用，主要對A型流感病毒具有活性，且作用強于金剛烷胺，中樞神經(jīng)副作用小于金剛烷胺［3］。在畜牧養(yǎng)殖上，金剛烷胺類藥物主要用于雞禽流感的預(yù)防和早期治療，以及豬傳染性胃腸炎的防治，但是其致精神異常的副反應(yīng)以及日增的耐藥性對畜產(chǎn)品消費者存在較大安全風(fēng)險［4－5］。美國FDA已明確禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用此類藥物［6］。我國農(nóng)業(yè)部考慮到金剛烷胺類藥物用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動物疫病防控政策的實施，在農(nóng)業(yè)部560號公告中已明令禁止金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)［7］。然而，仍有不法分子在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用該類藥物，最近爆發(fā)的“速生雞”問題更是將這類藥物的使用問題推向了風(fēng)口浪尖，甚至一度造成了消費者的恐慌。

目前，關(guān)于該類藥物報道較多的是人血漿和藥物中金剛烷胺類藥物的測定方法，主要包括氣相色譜（GC）法［1，3］、液相色譜（LC）法［8－11］、毛細管電泳（CZE）法［12］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS／MS）法［13－16］等。LC－MS／MS法因具有高效分離和集多組分定性、定量于一體等優(yōu)異性能，成為近年來獸藥殘留檢測方法研究的主要方向［17－18］，例如云環(huán)等［16］采用 LC－MS／MS法建立了動物源性食品中金剛烷胺的檢測方法。本研究將建立金剛烷胺和金剛乙胺的同時檢測技術(shù)，以有效解決該類藥物在雞肉、雞肝、豬肉和豬肝等動物源性食品中的檢測技術(shù)難題，并對樣品前處理方法和儀器分析條件進行系統(tǒng)優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

Waters Alliance 2695 液 相 色 譜 儀－Micromass Quattro Micro串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國 Waters公司產(chǎn)品，配 MassLynx V4.1軟件；3k30型冷凍離心機：美國Sigma公司產(chǎn)品；MS3minishaker旋渦混勻器：德國IKA公司產(chǎn)品；XS－205電子天平：瑞士Mettler公司產(chǎn)品；12位水浴型氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；20通道固相萃取裝置：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

鹽酸金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品：購自中國藥品生物制品檢定所；鹽酸金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)品：購自美國藥典（USP）；乙腈（色譜純）：美國 Merck公司產(chǎn)品；實驗用水為Milli－Q超純水；其它試劑均為分析純；Oasis MCX 混合陽離子交換柱 （60mg／3mL）：美國 Waters公司產(chǎn)品。

取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后，配制成100mg／L貯備溶液，置于－20℃冰箱中保存。分別吸取適量的貯備溶液（標(biāo)準(zhǔn)溶液），置于同一容量瓶中，用甲醇溶解成1.0mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)需要，吸取適量上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，添加空白樣品洗脫液，氮氣吹干后，用V（甲醇）∶V（0.2%甲酸）＝10∶90的溶液配制成不同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 Waters Atlantis dC18色譜柱（150mm×3.0mm×3.0μm），柱溫30℃，進樣量20μL，流速0.30mL／min，洗脫梯度條件列于表1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），離子源溫度120℃，脫溶劑溫度400℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，其中脫溶劑氣流速550L／h，錐孔氣流速50L／h，光電倍增器電壓650V，毛細管電壓3.0kV，萃取電壓2V。碰撞氣為高純氬氣，控制碰撞室壓力0.3Pa，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式。母離子（Q1）／子離子（Q3）離子對均設(shè)為單位分辨，各離子對的駐留時間（dwell time）均為100ms，質(zhì)譜優(yōu)化條件列于表2。

表1 洗脫梯度條件Table 1 Gradient mobile phase for HPLC

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 稱?。?±0.02）g絞碎后試樣于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入10mLV（乙腈）∶V（1.0%三氯乙酸）＝50∶50的混合溶液進行提取，渦旋混勻2min，置于超聲波清洗器中超聲提取20min，中間振蕩2～3次，取出，以8 000 r／min離心10min，傾出上清液，備用。

1.4.2 凈化 取MCX混合陽離子固相萃取柱置于固相萃取裝置上，依次用3mL甲醇和3mL水潤洗活化，取5mL上清液經(jīng)MCX柱凈化，待近干時再用3mL水和3mL甲醇依次淋洗小柱，擠干后，用5mLV（氨水）∶V（甲醇）＝5∶95的溶液洗脫，收集洗脫液，60℃下氮氣吹干后，用1mLV（甲醇）∶V（0.2%甲酸）＝10∶90的溶液溶解殘渣，渦旋30s，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，上機測定。

表2 MRM監(jiān)測模式下金剛烷胺和金剛乙胺的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 2 MRM optimization conditions of amantadine and rimantadine

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

金剛烷胺類藥物極性較弱，其烷基部分的結(jié)構(gòu)具有特殊的對稱性，難溶于水，因此，臨床常使用其水溶的鹽酸鹽，結(jié)構(gòu)式示于圖1。由于該類藥物含有氨基，容易得到H＋而形成較為穩(wěn)定的［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子，因此選擇ESI正離子方式進行監(jiān)測。

圖1 金剛烷胺（a）和金剛乙胺（b）的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structures of amantadine（a）and rimantadine（b）

以V（甲醇）∶V（水）＝50∶50的溶液為流動相，采用“T”三通方式，以10μL／min流動注射方式對金剛烷胺和金剛乙胺的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，獲得藥物分子離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的特征碎片離子掃描圖，確定［M＋1］＋離子，并優(yōu)化電離電壓、錐孔電壓、離子源溫度等參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，以子離子掃描方式優(yōu)化碰撞能量和兩對子離子質(zhì)量數(shù)，確定MRM模式監(jiān)測條件，兩種化合物的子離子掃描圖示于圖2，此時的鑒別點（IPs）能滿足歐盟2002／657／EC決議要求［19］。MRM監(jiān)測模式下，雞肉基質(zhì)中金剛烷胺類藥物的選擇離子監(jiān)測色譜圖示于圖3，其添加濃度為10.0 μg／kg。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

電噴霧質(zhì)譜電離是溶液狀態(tài)電離，因此流動相的組成和配比不但影響目標(biāo)化合物的色譜行為，還會影響目標(biāo)化合物的離子化效率，從而影響檢測靈敏度，在正離子監(jiān)測方式下，水相中加入0.2%甲酸溶液有利于化合物的離子化。以目前常用的C18柱作為分離柱，選擇 Waters XTerra MS C18柱 （3.0mm×150mm×3.5 μm）、Waters symmetry C18柱（2.1mm×150 mm×3.5μm）和 Waters Atlantis dC18柱（3.0 mm×150mm×3.0μm）研究不同色譜柱的分離效果。實驗結(jié)果表明，以上3種色譜柱都能將被測藥物與雜質(zhì)較好的分離開，而 Waters Atlantis dC18柱（3.0mm×150mm×3.0μm）的分離效果更佳。

圖2 金剛烷胺（a）和金剛乙胺（b）的子離子掃描圖Fig.2 Daughter ion scans of amantadine（a）and rimantadine（b）

圖3 MRM模式下，雞肉中金剛烷胺和金剛乙胺的選擇離子色譜圖Fig.3 The selected ion chromatograms of amantadine and rimantadine at spiked chicken muscle in MRM mode

2.3 樣品前處理方法的確定

結(jié)合金剛烷胺類藥物立體對稱、末端接氨基的結(jié)構(gòu)，其提取方法可以考慮以甲醇、乙腈以及它們與酸堿溶液配制成一定濃度的混合溶液作為提取劑。本研究參考文獻［16］，結(jié)合1.0%三氯乙酸溶液在調(diào)節(jié)pH值的基礎(chǔ)上還具有沉淀蛋白的作用，選擇該溶液與甲醇、乙腈組成適宜濃度的混合溶液作為提取液，比較了不同配比提取液的提取效率，并對提取方法、提取時間等條件進行了研究，確定最佳條件。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，采用V（乙腈）∶V（1.0%三氯乙酸）＝50∶50的混合溶液作為提取液，對金剛烷胺和金剛乙胺的提取效果總體最佳。

復(fù)雜基質(zhì)中痕量檢測進行凈化時常采用固相萃取凈化方法，由于該類藥物含有氨基結(jié)構(gòu)，可以優(yōu)先考慮采用混合陽離子交換柱進行凈化。通過實驗比較了 Waters Oasis MCX柱（60mg／3mL）、Agilent Bond Elut Plexa PCX 柱 （60 mg／3mL）和博納艾杰爾Cleanert PCX（60mg／3mL）3種商品化固相萃取柱，根據(jù)各自的性能和廠家提供的方法優(yōu)化了條件。結(jié)果表明，3種小柱作為同時具有反相保留和離子交換行為的凈化柱，在凈化金剛烷胺和金剛乙胺時具有良好的色譜保留，回收率比較穩(wěn)定，相對而言Waters Oasis MCX柱效果更佳。因此，選擇 Waters Oasis MCX柱作為方法學(xué)研究的凈化柱。

2.4 方法線性方程和檢出限

配制與待測樣品相同基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，使其濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、100.0μg／L，分別以選定的定量離子峰面積y對濃度x（μg／L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。金剛烷胺類藥物在0.5～100.0μg／L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，金剛烷胺、金剛乙胺在雞肉、雞肝、豬肉、豬肝基質(zhì)中的線性方程和相關(guān)系數(shù)列于表3。采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，按1.4進行處理，以3倍信噪比確定檢測限（LOD），以10倍信噪比確定定量限（LOQ），結(jié)果列于表3。

表3 金剛烷胺和金剛乙胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Table 3 The linear equations，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of amantadine and rimantadine

2.5 回收率實驗

取同一批號的空白雞肉、雞肝、豬肉、豬肝樣品，加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使加標(biāo)濃度為1.0～100μg／kg，按1.4方法處理后，按1.3進行儀器分析。每個濃度測定5份樣品，求其平均回收率，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，實驗結(jié)果列于表4。

由表4可知，空白雞肉、雞肝、豬肉、豬肝樣品中，金剛烷胺類藥物的加標(biāo)濃度為1.0～100 μg／kg時，方法平均回收率在70.7%～92.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～11.7%，均取得了滿意結(jié)果，滿足了歐盟的有關(guān)法規(guī)要求［19］。

2.6 樣品分析

應(yīng)用建立的分析方法對48份實驗室留存和隨機抽取的雞肉、雞肝樣品進行測定，其中4份樣品中檢測出金剛烷胺，含量為12.6～90.5 μg／kg；但均未檢出金剛乙胺藥物殘留。

表4 不同基質(zhì)中回收率實驗結(jié)果（n＝5）Table 4 Results of recovery experiments in different matrix（n＝5）

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時測定動物組織中金剛烷胺和金剛乙胺殘留量的方法。在優(yōu)化提取液pH值及配比、SPE柱類型和過柱條件的基礎(chǔ)上，建立了混合陽離子交換柱凈化的前處理方法；通過對儀器檢測方法的系統(tǒng)研究，確定了液相色譜分離條件和質(zhì)譜監(jiān)測最佳條件；在此基礎(chǔ)上，建立了操作簡便、靈敏度和重復(fù)性均較好的LC－MS／MS分析方法。實驗結(jié)果表明，該方法在雞肉、雞肝、豬肉、豬肝等樣品中前處理方法易于控制、結(jié)果準(zhǔn)確、加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，適用于動物組織中金剛烷胺和金剛乙胺殘留的定性、定量測定，為我國開展相關(guān)藥物殘留檢測提供了依據(jù)。

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